İndüksiyon bağırsak Graft - versus - host hastalığı ve canlı fareler, Mini-endoskopik değerlendirme
Summary
Burada, Allojeneik Hematopoietik kök hücre transplantasyonu açıklar ve distal kolonun tekrarlayan mini-endoskopik değerlendirme yerinde varlığı, özellikleri ve canlı içinde kolon iltihabı şiddeti için izin veren bir protokol mevcut bağırsak graft – versus – host hastalığı fareler.
Abstract
Akut Greft – versus – host hastalığı (GvHD) en ciddi komplikasyonu daha önce Allojeneik Hematopoietik kök hücre nakli (allo-HCT) yüz geçiren hastalar temsil eder ve sık sık bir zavallı klinik sonuçlar ile ilişkilidir. Süre, örneğin, deri belirtileri GvHD genellikle kurulan bağışıklık baskılayıcı tedavilere cevap vardır ve bu nedenle, önemli bir ders, varlığı ve özellikle parçalarının orta-için-alt bağırsak bağırsak GvHD yoğunluğunu almıyorsun güçlü etkisi sonucu ve genel olarak hasta akut GvHD. tedavi olanakları ile yaşama aslında sadece orta etkileri hastalık için Azaltıcı verimli klasik bağışıklık baskılayıcı acentelere sınırlı. Bu nedenle, doku yerleşik bağışıklık cascade hakkında detaylı bilgi bağırsak microbiota değiştirir ve stromal yanıt önceden üzerine ve bağırsak GvHD başlangıçlı sonra acilen olaylar ve altta yatan mekanizmaları anlamak için gereken onun patogenez ve yenilikçi tedavi olanakları geliştirmek için. Fare modelleri GvHD sık tanımlamak ve işlevsel moleküller ve putatively bağırsak GvHD sürüş yolları değerlendirmek için istihdam edilmektedir. Değerlendirmek ve akut GvHD notu için kurulan puanları düzenli olarak sistemik GvHD oldukça yansıtan çeşitli parametrelerin oluşmaktadır beri Ancak, özel olarak izlemek ve bağırsak iltihabı zaman içinde değerlendirmek anlamına gelir aslında eksik bulgular. Bağırsak GvHD ayrıntılı değerlendirme çalışmaları böylece aslında boyuna hariç olmak üzere fare, ötenazi kullanarak sınırlama getirildi (yani, kinetik) kolon bölmenin altında verilen bir deneysel koşul analizleri (örneğin, antikor aracılı proinflamatuar sitokin abluka) (yani, in vivo) canlı farelerde. Mini-endoskopik yerinde değerlendirme burada açıklanan allo HCT tedavi farelerin distal kolon bağırsak iltihabı ve b) seçeneği aşağı akım analizleri için doku örneği toplamak için farklı yönleri ayrıntılı bir) bir makroskopik değerlendirme sağlar Gözlem süresi boyunca çeşitli zaman puan. Genel olarak, mini-endoskopik yaklaşım preklinik noninvaziv izleme ve bağırsak GvHD değerlendirilmesi büyük bir ilerleme sağlar.
Introduction
Hematopoetik maligniteler, doğrudan hematopoetik kök hücre bölmesi ve kontrolsüz doğan hızla ilerliyor ve ağır immün aracılı bozuklukları çoğu kez allo-HCT1,2gerçekleştirmek için göstergeler. Ancak, her ne kadar prognostik yararlı Greft-versus-tümör yanıt dosyasının örneği için muhasebe, donör lenfositler sık inducing ve sağlıklı doku bileşenleri allo-HCT alıcı içinde istenmeyen bir immün aracılı saldırıya teşvik , Greft – versus – host hastalığı3olarak adlandırılan bir süreç. Belirtiler gut, sözde bağırsak GvHD akut GvHD, hangi ciddi formları ile yüksek ölüm oranı1,2,4rutin olarak ilişkili en korkulan komplikasyonu temsil eder.
Allo-HCT genel olarak, fare modelleri tanımlamak ve bağışıklık aracılıklı mekanizmalar GvHD5patogenezinde temel eğitim için çok değerli araçlar ortaya çıkmıştır. Ancak, kinetik değerlendirilmesi, örneğin, yararlı etkileri zaman içinde canlı fareler roman tedavi müdahaleler rutin dayanan klinik GvHD belirlenmesi puanları6. Bu sınavların yansıtmak uygun olmakla birlikte, örneğin, genel hastalık yükü (yani, sistemik GvHD), klinik olmaması güvenilir bir şekilde organ özgü belirtiler ayna için duyarlılık puanları (örneğin, gut). Bu nedenle, sonuçlar, örneğin bu sistemleri genellikle Puanlama dayanır gut-koruyucu etkileri belirli bir terapötik müdahale açısından yetersiz kalmaktadır.
Roman tüm vücut icadı ile önemli gelişmeler rağmen yöntemleri yöntemleri doğrudan ve özellikle her iki kollarındaki veya floresan genetik fare modelleri7,8, belgili tanımlık kullanım ile birlikte görüntüleme bağırsak değerlendirmek GvHD tezahürü canlı farelerde eksik. Dolayısıyla, bu engeli aşmak için sonraki bölümde açıklanan bağırsak GvHD fenotip endoskopik değerlendirme protokolü arkasındaki mantığı olduğunu. Ayrıca, motivasyon defa, hücresel, morfolojik ve moleküler özellikleri detaylı bir değerlendirmesini beri deneysel fareler numaraları azaltmak da (örneğin, histopatoloji veya moleküler biyoloji), bağırsak GvHD tezahürü sonuçta deneysel fare kurban gerektirmiştir.
Bizim kurum daha önce syngeneic kolit modelleri9sırasında kolon tezahürlerini bir mini-endoskopik değerlendirme metodolojisi olarak bildirdi. Burada sunulan iletişim kuralında, biz rafine ve colonoscopic uyarlanmış bir MHC sınıf HCT ve donör lenfosit alloreactive nakli üzerine bağırsak GvHD ile canlı farelerde alloresponse tahrik kolit için matris Puanlama ben tamamen ayarı uyumsuz . Biz dört parametre GvHD ilgili bağırsak kolon lezyonlar yansıtmak uygun tespit. Ayrıca, kolayca bağırsak GvHD belirli bir fare bir zaman noktasında bulunması önem derecesi hakkında okuyucu bilgilendirir yeni bir skor sonuçlanan herhangi bir tek belirleyici, ince ayarlı bir sınıflandırma sağlayan bir sistem kurduk. Histopatolojik analizleri üzerinde belirli bir eşiğe endoskopik bir skor orta yüksek sınıf doku iltihabı güvenilir bir şekilde tahmin doğruladı. Bu nedenle, mini-endoskopik değerlendirme rutin olarak deneysel farelerin fedakarlık gerektirir altın standart histopatoloji çalışma yerine göstermek için görünür. Önemlisi, bu iletişim kuralını hemen hemen herhangi bir zamanda noktada uygulanabilir ve hastalık10,11boyunca tekrar tekrar kullanılabilir. Ayrıca, bioluminescence bağımlı yaklaşımlar kullanımı aksine, ışığını genetik olarak değiştirilmiş fareler gibi emek yoğun ve zaman alan ölçümleri gereklidir ve bu nedenle, hemen hemen herhangi bir fare hat üzerinde metodoloji uygulanabilir faiz.
Birlikte, allo-HCT hastalarda şiddetli bağırsak GvHD, zararlı klinik açıdan verilen alınan hızlı bilimsel ilerleme ve bağışıklık patogenezinde temel moleküler mekanizmaları içine daha fazla fikir acilen ihtiyaç vardır. Benzer şekilde, önemli, etik konuları bilgi kazanç deneysel fareler en az sayıda kullanımı ile elde edilmelidir talep ediyorum. Bu nedenle, her ikisi de bağırsak GvHD keşfetmek araştırma topluluğu alacaklar izlemek ve canlı deneysel Mouse bağırsak GvHD notu için deneysel çalışma zincirindeki kolon seri mini-endoskopik değerlendirme uygulayarak gelişmiş olabilir tanıdı modelleri, açıklanan ve burada sunulan protokolündeki doğrulanmış olarak.
Protocol
Representative Results
Discussion
İndüksiyon metodolojisi ve mini-endoskopik kolon fenotip bağırsak GvHD sırasında gözlenen değerlendirmenin protokolünü açıklar. Bu bağırsak GvHD boyuna ve noninvazif (yani, başlangıcından kolon tezahürü ve ilerleme maksimal hastalık aktivitesi kadar) tüm hastalığı boyunca çalışmaya bilim adamları daha geniş amacı hizmet vermektedir.
Ancak, orada bazı önemli adımlar ve önemli sınırlamalar deneyci teknolojileri ilgili bilimsel bağlamda uygulanmadan önce dikk…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmada ortak araştırma merkezleri (CRC) 221 (CRC/TR221-DFG, #324392634; proje B03) (için K.H.) ve CRC 1181 (CRC-DFG, proje B05) (için K.H.) tarafından desteklenen, her ikisi de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Alman Araştırma Vakfı) tarafından finanse edilen.
Materials
| BIOBEAM 2000 Gamma Irradiator | Gamma-Service Meical GmbH | ||
| Phosphate-buffered saline (PBS ) | Sigma-Aldrich Co. LLC. | D8662-6x500ML | |
| Semken Forceps (lenght: 13 cm; serrated, curved tips) | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Hardened Fine Scissors (lenght: 8,5 cm; straight tips; cutting edge: 24 mm) | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich Co. LLC. | R8758-500ML | |
| Hypodermic needle (26G) | B. Braun Melsungen AG | 4657683 | |
| 1 mL syring | B. Braun Melsungen AG | 9166017V | |
| 50 mL tube | Sarstedt Ag & Co.KG | 62,547,254 | |
| Cell strainer with a 40 µm mesh screen | BD Falcon | 352340 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 11209 | ingredient of ACK lysing buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na2EDTA) | Carl Roth GmbH & Co.KG | 8043.2 | ingredient of ACK lysing buffer |
| Potassium bicarbonate (KHCO3) | Merck KGaA | 1,048,540,500 | ingredient of ACK lysing buffer |
| CD90.2 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec GmbH | 130-049-101 | magnet cell separation to isolate T cell-depleted bone marrow cells |
| Pan T Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi Biotec GmbH | 130-095-130 | magnet cell separation to isolate splenic T cells |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 Antibody (clone: 104; lot: B252126; RRID: AB_493731) | Biolegend | 109822 | |
| Pacific Blue anti-mouse CD3 Antibody (clone: 17A2; lot: B227246; RRID: AB_493645) | Biolegend | 100214 | |
| FITC anti-mouse CD4 Antibody (clone: GK1.5; lot: B225057; RRID: AB_312691) | Biolegend | 100406 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 Antibody (clone: A20; lot: B217246; RRID: AB_1134168) | Biolegend | 110730 | |
| APC/Cy7 anti-mouse CD8a Antibody (clone: 53-6.7, lot: B247008; RRID: AB_312753) | Biolegend | 100714 | |
| Filtrated bovine serum | Pan Biotec | P40-47500 | ingredient of FACS buffer |
| 96-well polystyrene V-bottom plates | Greiner Bio-One | 651201 | |
| Polystyrene Round-Bottom Tube (5 mL) | Falcon | 352052 | |
| BD LSRFortessa II flow cytometer | BD Bioscience Co. | ||
| Insulin syringe with sterile interior (30G) | BD | 324826 | |
| Oxy Vet Oxymat 3 | Eickemeyer | oxygen concentrator for anesthesia | |
| NarkoVet | Eickemeyer | 213062 | |
| Plexiglass chamber | Eickemeyer | 214620 | |
| Straight Forward Telescope | KARL STORZ SE &Co KG | 64301 AA | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Protection and Examination Sheath | KARL STORZ SE &Co KG | 61029 C | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Examination Sheath with working channel | KARL STORZ SE &Co KG | 61029 D | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Biopsy Forceps | KARL STORZ SE &Co KG | 61071 ZJ | part of the experimental setup for colonoscopy |
| 175 Watt SCB XenonLight Source | KARL STORZ SE &Co KG | 20132120 | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Fiber Optic Light Cable | KARL STORZ SE &Co KG | 495 NL | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Image 1 S3 Camera Head | KARL STORZ SE &Co KG | 22220030 | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Image 1 SCB Camera Control Unit | KARL STORZ SE &Co KG | 22200020 | part of the experimental setup for colonoscopy |
| LCD monitor | Olympus | OEV181H | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Forane / Isofluran | AbbVie Inc. | B506 | |
| Formaldehyde solution 37 % | Carl Roth GmbH & Co.KG | 7398.1 | |
| 5,0 mL Dispenser tip | Eppendorf AG | 30089456 |
References
- Ferrara, J. L., Levine, J. E., Reddy, P., Holler, E. Graft-versus-host disease. The Lancet. 373, 1550-1561 (2009).
- Magenau, J., Runaas, L., Reddy, P. Advances in understanding the pathogenesis of graft-versus-host disease. British Journal of Haematology. 173, 190-205 (2016).
- Ball, L. M., Egeler, R. M., Party, E. P. W. Acute GvHD: pathogenesis and classification. Bone Marrow Transplantation. 41, 58-64 (2008).
- Naymagon, S., et al. Acute graft-versus-host disease of the gut: considerations for the gastroenterologist. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14, 711-726 (2017).
- Zeiser, R., Blazar, B. R. Preclinical models of acute and chronic graft-versus-host disease: how predictive are they for a successful clinical translation. Blood. 127, 3117-3126 (2016).
- Cooke, K. R., et al. An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin. Blood. 88, 3230-3239 (1996).
- Anthony, B. A., Hadley, G. A. Induction of graft-versus-host disease and in vivo T cell monitoring using an MHC-matched murine model. Journal of Visualized Experiments. (66), e3697 (2012).
- Beilhack, A., et al. Prevention of acute graft-versus-host disease by blocking T-cell entry to secondary lymphoid organs. Blood. 111, 2919-2928 (2008).
- Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nature Protocols. 1, 2900-2904 (2006).
- Buchele, V., et al. Targeting Inflammatory T Helper Cells via Retinoic Acid-Related Orphan Receptor Gamma t Is Ineffective to Prevent Allo-Response-Driven Colitis. Frontiers in Immunology. 9, 1138 (2018).
- Ullrich, E., et al. BATF-dependent IL-7RhiGM-CSF+ T cells control intestinal graft-versus-host disease. The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 916-930 (2018).
- Kaplan, D. H., et al. Target antigens determine graft-versus-host disease phenotype. Journal of Immunology. 173, 5467-5475 (2004).
