Grensesnitt Microfluidics med Microelectrode matriser for å studere Neuronal kommunikasjon og Axonal Signal overføring
Summary
Denne protokollen mål å demonstrere hvordan kombinere i vitro microelectrode matriser med microfluidic enheter for å studere handling potensial overføring i neuronal kulturer. Dataanalyse, nemlig gjenkjenning og karakterisering for handlingen potensialene, er utført med en ny avansert, men brukervennlig og fritt tilgjengelig, beregningsorientert verktøy.
Abstract
Microelectrode matriser (tiltak) er mye brukt til å studere neuronal funksjon i vitro. Disse enhetene kan samtidig ikke-invasiv opptak/stimulering av elektrofysiologiske aktivitet i lange perioder. Men kan for sensing signaler fra alle kilder rundt hver microelectrode bli ugunstig når du prøver å forstå kommunikasjon og signal overføring i nevrale kretser. I nevrale nettverk, flere neurons kan aktiveres samtidig og kan generere overlappende handling potensialene, gjør det vanskelig å diskriminere og spore signalet overføring. Vurderer denne begrensningen, har vi etablert en i vitro oppsett fokusere opp på taksere elektrofysiologiske kommunikasjon, som kan isolere og forsterke axonal signaler med høy romlig og tidsmessige oppløsning. Ved grensesnitt microfluidic enheter og tiltak, er vi kunne fordeler neuronal kulturer med en godt kontrollerte justeringen av axons og microelectrodes. Dette oppsettet gjør opptak av spike overføring med høy signal-til-støy forholdet i løpet av ukene. Kombinert med spesialiserte data analysealgoritmer, det gir detaljert kvantifisering av flere kommunikasjon egenskaper som overføring hastighet, ledning svikt, skyte rate, anterograd toppene og koding mekanismer.
Denne protokollen demonstrerer hvordan du oppretter en compartmentalized neuronal kultur oppsett over substrat integrert tiltak, slik kultur nerveceller i dette oppsettet og hvordan å kunne registrere, analysere og tolke resultatene fra slike eksperimenter. Her viser vi hvordan den etablerte setup forenkler forståelsen av neuronal kommunikasjon og axonal signalet overføring. Disse plattformene bane vei for nye i vitro modeller med utvikling og kontrollerbar nevrale nettverk topografi. De kan brukes i konteksten av homogen neuronal kulturer, eller med co kultur konfigurasjoner der, for eksempel kommunikasjon mellom sensoriske neurons og andre celletyper er kontrollert og vurdert. Dette oppsettet gir svært interessant betingelser for å studere, for eksempel neurodevelopment, nevrale kretser, informasjon koding, neurodegeneration og neuroregeneration tilnærminger.
Introduction
Forstå electrical kommunikasjon i nevrale kretser er en grunnleggende skritt å avsløre normal funksjon, og utarbeide strategier for å håndtere dysfunksjon. Neurons integrere, beregne og videresende handling potensialer (APs) som overføres langs sin tynne axons. Tradisjonelle elektrofysiologiske teknikker (f.eks oppdateringen klemme) er kraftige teknikker å studere neuronal aktivitet, men er ofte begrenset til større cellular strukturer, som soma eller dendrites. Imaging teknikker tilbyr et alternativ for å studere axonal signaler med høy romlig oppløsning, men de er teknisk vanskelig å utføre og tillater ikke langsiktige mål1. I denne sammenheng, kan kombinasjonen av microelectrode matriser (tiltak) og microfluidics gi et kraftig bidrag i å bringe de grunnleggende egenskapene for neuron´s aktivitet og signal overføring innen nevrale nettverk i vitro2 , 3.
MEA teknologi avhengig ekstracellulære opptak av neuronal kulturer. De viktigste fordelene med denne elektrofysiologiske metoden er dens evne til å støtte langsiktig og samtidige stimulering og opptak på flere områder og i en ikke-invasiv måte3. Tiltak er laget av biokompatible, høy ledende og korrosjonsbestandige microelectrodes innebygd i et glass wafer substrat. De er kompatible med konvensjonelle celle kultur bio-belegg, som fremmer celleadhesjon betydelig øker tetting motstanden mellom substrat og celler3,4. Dessuten, de er allsidig design og kan variere i microelectrodes størrelse, geometri og tetthet. Samlet fungere tiltak som vanlig celle kultur fartøy med fordelen at samtidig live-imaging og elektrofysiologiske opptak/stimulering.
Bruk av MEA teknologi har bidratt til studiet av viktige funksjoner av neural nettverk5. Men er det iboende egenskaper som begrenser ytelsen til tiltak for å studere kommunikasjon og APs forplantning i en neuronal krets. Tiltak aktiverer opptak fra enkeltceller og selv subcellular strukturer som axons, men sammenlignet med somal signaler, axonal signaler har en svært lav signal-til-støy-forhold (SNR)6. Videre hemmer karakteristiske sensing ekstracellulære feltet potensialer fra alle kilder rundt hver microelectrode sporing av signalet overføring i en neuronal krets.
Nyere studier har vist, men at bedre opptak forhold kan oppnås ved å ha microelectrodes justert i smale microchannels som axons kan vokse. Denne konfigurasjonen gir betydelig økning i SNR slik at spre axonal signaler kan være lett oppdaget7,8,9,10,11,12, 13. Strategien for å alliere seg microfluidic enheter med MEA teknologi skaper en elektrisk isolert microenvironment egnet til å forsterke axonal signaler11. Videre, tilstedeværelse av flere sensing microelectrodes langs en Mikrokuttspor er grunnleggende for deteksjon og karakterisering av axonal signalet overføring.
Slike i vitro plattformer med svært kontrollerbare nevrale nettverk topografi kan tilpasses mange forskning spørsmål14. Disse plattformene er passende å bli anvendt i sammenheng med neuronal kulturer, men kan bli utvidet til å ingeniør co kultur konfigurasjoner, der kommunikasjonen mellom nerveceller og andre celletyper kan bli kontrollert og vurdert. Dette oppsettet gir dermed veldig interessant forhold å utforske en rekke neural-relaterte studier som neurodevelopment, nevrale kretser, informasjon koding, neurodegeneration og neuroregeneration. I tillegg kan kombinasjonen med nye modeller av menneskelig indusert pluripotent stamceller15,16 åpne nye veier i utviklingen av potensielle terapi for menneskelige sykdommer som påvirker nervesystemet.
Våre lab bruker denne plattformen forbinder microelectrodes med microfluidics (µEF) for å forstå neuronal prosesser på cellular og nettverket nivå og deres konsekvensen i physio- og patologisk nervesystemet. Gitt verdien av slik plattform innen nevrovitenskap, formålet med denne protokollen er å skape en compartmentalized neuronal kultur over substrat integrert tiltak, hvordan kultur nerveceller i denne plattformen og hvordan inn, analysere og tolke resultatene fra slike eksperimenter. Denne protokollen vil sikkert berike eksperimentelle verktøykassen for neuronal kulturer i studiet av nevrale kommunikasjon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen presenteres her viser hvordan å montere en µEF, en microfluidic-enhet og en MEA med standard kommersielt tilgjengelig design, og analysere de innspilte dataene.
Når du utformer et eksperiment, må forskere ta hensyn til at modellen i vitro er begrenset av MEA faste rutenettet, som begrenser Mikrokuttspor ordninger. Bruk av en bestemt microfluidic eller MEA design vil avhenge av eksperimentelle behovene, men vanligvis samme fremgangsmåten skal gjelde for ulike µEF konf…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble finansiert av FEDER – Fundo Europeu de Desenvolvimento regionale midler gjennom KONKURRERE 2020 – Operacional program for konkurranseevne og internasjonalisering (POCI), Portugal 2020, og av portugisisk midler gjennom FCT – Fundação para en Ciência e en Tecnologia / Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior i rammen av prosjektet PTDC/CTM-NAN/3146/2014 (POCI-01-0145-FEDER-016623). José C Mateus ble støttet av FCT (PD/BD/135491/2018). Paulo Aguiar ble støttet av Programa Ciência – Programa Operacional Potencial Humano (POPH) – kampanjen av vitenskapelige sysselsetting, ESF og MCTES og program Investigador FCT, POPH og Fundo sosiale Europeu. Microfluidic enhetene ble laget på INESC – Microsystems og nanoteknologi, Portugal, under oppsyn av João Pedro Conde og Virginia Chu.
Materials
| B-27 Suplement (50X) | Thermo Fisher Scientific | LTI17504-044 | |
| Branched poly(ethylene imine) (PEI), 25 kDa | Sigma-Aldrich | 408727 | Purify branched PEI by dialysis using a 2.5 kDa cut-off membrane for 3 days at 4°C against a 5 mM HCl solution (renewed daily). Freeze-dry the purified PEI. |
| Cell strainer (40 µm) | Falcon | 352340 | |
| Conical microtubes (1.5 ml) | VWR | 211-0015 | |
| Disposable diaper, 60×40 cm | Bastos Viegas SA | 455-019 | |
| Forceps Dumont #5, straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Forceps Dumont #5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Forceps Dumont #7, curved | Fine Science Tools | 91197-00 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Premium | Biowest | S181BH-500ML | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | Prepare laminin stock solution at 1 mg/mL by dissolving the powder in the respective volume of non-supplemented medium. Store laminin solution at -20 °C in small aliquots (20 µL) to avoid repeated freeze/thaw cycles. |
| L-Glutamine 200mM | Thermo Fisher Scientific | LTID25030-024 | |
| Neubauer improved counting chamber (hemocytometer) | Marienfeld | 630010 | |
| Neurobasal Medium (1X) | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | Basal medium used for neuronal cultures |
| PDMS microfluidic devices | not applicable | not applicable | Composed of two cell seeding compartments interconnected by 20 microgrooves with 450 μm length × 10 μm height × 14 μm width dimensions and separated by 86 µm (total interspace of 100 μm). |
| Penicillin-streptomycin (P/S) solution (100X) | Biowest | L0022-100 | |
| PES syringe filter unit (Ø 30 mm), 0.22 µm | Frilabo | 1730012 | |
| Polypropylene conical tubes, 15 ml | Thermo Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| Polypropylene conical tubes, 50 ml | Thermo Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 10 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 5 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Standard Regenerated cellulose membrane (2 kDa) | Spectrum labs | 132107 | |
| Standard surgical scissor | Fine Science Tools | 91401-14 | |
| Substrate-integrated planar MEAs (256 microelectrodes) | Multi Channel Systems | 256MEA100/30iR-ITO | 252 titanium nitride (TiN) recording electrodes and 4 internal reference electrodes organized in a 16 by 16 square grid. Each recording electrode is 30 µm in diameter and interspaced by 100 µm. |
| Syringe luer-lock tip, 10 ml | Terumo Europe | 5100-X00V0 | |
| Syringe luer-lock tip, 50 ml | Terumo Europe | 8300006682 | |
| Terg-A-Zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | Enzyme-active powdered detergent used for MEAs cleaning |
| Tissue culture plates, 35 mm | StemCell Technologies | 27150 | |
| Tissue culture plates, 90 mm | Frilabo | 900095 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Trypsin (1:250) | Thermo Fisher Scientific | 27250018 | |
| Vinyl tape 471 | 3M | B40071909 |
References
- Scanziani, M., Hausser, M. Electrophysiology in the age of light. Nature. 461 (7266), 930-939 (2009).
- Nam, Y., Wheeler, B. C. In vitro microelectrode array technology and neural recordings. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39 (1), 45-61 (2011).
- Obien, M. E., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 8, 423 (2014).
- Blau, A. Cell adhesion promotion strategies for signal transduction enhancement in microelectrode array in vitro electrophysiology: An introductory overview and critical discussion. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 18 (5), 481-492 (2013).
- Jones, I. L., et al. The potential of microelectrode arrays and microelectronics for biomedical research and diagnostics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (7), 2313-2329 (2011).
- Bakkum, D. J., et al. Tracking axonal action potential propagation on a high-density microelectrode array across hundreds of sites. Nature Communications. 4, 2181 (2013).
- Claverol-Tinture, E., Cabestany, J., Rosell, X. Multisite recording of extracellular potentials produced by microchannel-confined neurons in vitro. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 54 (2), 331-335 (2007).
- Fitzgerald, J. J., Lacour, S. P., McMahon, S. B., Fawcett, J. W. Microchannels as axonal amplifiers. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 55 (3), 1136-1146 (2008).
- Dworak, B. J., Wheeler, B. C. Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture. Lab on a Chip. 9 (3), 404-410 (2009).
- Morin, F., et al. Constraining the connectivity of neuronal networks cultured on microelectrode arrays with microfluidic techniques: a step towards neuron-based functional chips. Biosensors and Bioelectronics. 21 (7), 1093-1100 (2006).
- Pan, L., et al. Large extracellular spikes recordable from axons in microtunnels. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 22 (3), 453-459 (2014).
- Lewandowska, M. K., Bakkum, D. J., Rompani, S. B., Hierlemann, A. Recording large extracellular spikes in microchannels along many axonal sites from individual neurons. PLoS One. 10 (3), e0118514 (2015).
- Narula, U., et al. Narrow microtunnel technology for the isolation and precise identification of axonal communication among distinct hippocampal subregion networks. PLoS One. 12 (5), e0176868 (2017).
- Forro, C., et al. Modular microstructure design to build neuronal networks of defined functional connectivity. Biosensors and Bioelectronics. 122, 75-87 (2018).
- Frega, M., et al. Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays. Journal of Visualized Experiments. (119), (2017).
- Tukker, A. M., Wijnolts, F. M. J., de Groot, A., Westerink, R. H. S. Human iPSC-derived neuronal models for in vitro neurotoxicity assessment. Neurotoxicology. 67, 215-225 (2018).
- Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on micro-electrode arrays (MEAs). Journal of Visualized Experiments. (39), (2010).
- van Pelt, J., Wolters, P. S., Corner, M. A., Rutten, W. L., Ramakers, G. J. Long-term characterization of firing dynamics of spontaneous bursts in cultured neural networks. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 51 (11), 2051-2062 (2004).
- Wagenaar, D. A., Pine, J., Potter, S. M. An extremely rich repertoire of bursting patterns during the development of cortical cultures. BMC Neuroscience. 7, 11 (2006).
- Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxygen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
- Heiney, K., et al. . μSpikeHunter: An advanced computational tool for the analysis of neuronal communication and action potential propagation in microfluidic platforms. , (2018).
