Nöronal iletişim ve aksonal sinyal yayma çalışmak için elektrot dizileri ile ara yüz kullanımını Havacilik
Summary
Bu iletişim kuralı mikrosıvısal aygıtlarla çalışmak için nöronal kültürler iletimde Aksiyon potansiyeli vitro elektrot dizilerin nasıl göstermek amaçlamaktadır. Veri analizi, yani algılama ve karakterizasyonu Aksiyon potansiyelleri, yayma, gerçekleştirilen yeni bir kullanarak gelişmiş, henüz Kullanıcı dostu ve serbestçe kullanılabilir, hesaplama aracı.
Abstract
Elektrot dizilerin (ölçü) yaygın olarak nöronal fonksiyon vitroincelemek için kullanılır. Bu cihazlar için uzun dönem eşzamanlı non-invaziv kayıt/stimülasyon elektrofizyolojik faaliyet izin. Ancak, her elektrot çevresinde tüm kaynaklardan gelen sinyalleri algılama özelliği iletişim anlamak ve nöronal devreler yayılmasında sinyal çalışırken olumsuz hale gelebilir. Nöronal ağ çeşitli nöronların aynı anda aktif olması ve çakışan Aksiyon potansiyelleri, ayrımcılık ve sinyal yayma izlemek üzere çıkarabilirsiniz. Bu sınırlama göz önüne alındığında, biz izole ve aksonal sinyalleri yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlük ile yükseltmek yapabiliyor elektrofizyolojik iletişim değerlendirilmesi odaklı bir vitro Kur kurduk. Mikrosıvısal aygıtlar ve ölçü arabirim tarafından biz iyi kontrollü uyum akson ve microelectrodes nöronal kültürlerle bölümlendirirse edebiliyoruz. Bu kurulum birkaç hafta boyunca spike yayma yüksek sinyal gürültü oranı ile kayıtları verir. Özel veri analizi algoritmaları ile birlikte, çeşitli iletişim detaylı miktar sağlar ilgili yayılma hızı, iletim hatası, ateş oranı, Anterograd sivri gibi özellikler ve mekanizmaları kodlama.
Bu iletişim kuralı bir compartmentalized nöronal kültür kurulumu substrat entegre ölçü nasıl oluşturulacağı, nasıl bu kurulum nöronlarda kültür ve başarıyla kaydetmek, analiz etmek ve bu deneylerin sonuçlarını yorumlamak nasıl gösterir. İşte, nasıl kurulan Kur nöronal iletişim ve aksonal sinyal yayma anlayış kolaylaştırır göstermektedir. Bu platformlar yeni vitro modelleri ile mühendislik ve kontrol edilebilir nöronal ağ Topografyaları önünü. İçerikte homojen nöronal kültürlerin, ya da, örneğin, duyusal sinir hücreleri ve diğer hücre tipleri arasındaki iletişimi değerlendirildi ve izlendiği ortak kültür konfigürasyonları ile kullanılabilir. Bu kurulum, örneğin, çalışmaya açıkların, nöronal devreler, kodlama, ateş ve neuroregeneration yaklaşımlar bilgi çok ilginç koşullar sağlar.
Introduction
Nöronal devreler elektrik iletişimde anlayış normal fonksiyon açığa vurmak ve fonksiyon bozukluğu gidermek için tedavi stratejileri vasiyetle için temel bir adımdır. Nöronlar entegre, hesaplamak ve aksiyon potansiyelleri (APs) onların ince akson yaymak geçiş. Geleneksel elektrofizyolojik teknikleri (Örneğin, yama kelepçe) nöronal aktivite çalışmaya güçlü teknikleri vardır ama genellikle daha büyük hücresel yapılar, soma veya dendrites gibi sınırlıdır. Görüntüleme teknikleri teklif aksonal sinyalleri yüksek uzaysal çözünürlük ile çalışmak için bir alternatif, ama teknik olarak zordur gerçekleştirmek ve uzun vadeli ölçümleri1izin vermez. Bu bağlamda, elektrot dizilerin (ölçü) ve havacilik neuron´s etkinliği ve sinyal iletim nöronal ağlar vitro2 içinde temel özelliklerini ifşa içinde güçlü bir katkı yapabilir , 3.
MEA teknoloji nöronal kültürlerin ekstraselüler kayıtlarda dayanır. Uzun vadeli, eşzamanlı stimülasyon ve kayıt birden çok site ve non-invaziv yolu3desteklemek için onun yetenek bu elektrofizyolojik metodoloji başlıca avantajları şunlardır. Bana cam gofret alt katman içinde gömülü biyouyumlu, yüksek iletken ve korozyona dayanıklı microelectrodes yapılır. Bunlar geleneksel hücre kültür biyo-kaplamalar, hangi hücre adezyon önemli ölçüde teşvik substrat ve hücreleri3,4arasında sızdırmazlık direnç artışı ile uyumludur. Ayrıca, onlar tasarımında çok yönlü ve microelectrodes boyutu, geometri ve yoğunluğu değişebilir. Genel olarak, ölçü olarak geleneksel hücre kültür damarları eşzamanlı canlı görüntüleme ve elektrofizyolojik kayıtlar/dürtme izin avantajı ile çalışıyorum.
MEA teknolojinin kullanımı, sinir ağları5önemli özellikleri çalışma için katkıda bulunmuştur. Ancak, iletişim ve nöronal devre yayılmasında APs eğitimi için bana performansını sınırlayan doğal özellikleri vardır. Bana tek hücreleri ve aksonlar gibi bile hücre altı yapıları kayıtları etkinleştirir ancak somal sinyallere karşılaştırıldığında çok düşük sinyal-gürültü oranı (SNR)6aksonal sinyalleri var. Ayrıca, hücre dışı alan potansiyelleri her elektrot çevresinde tüm kaynaklardan gelen algılama karakteristik sinyal yayma nöronal devre izleme engellemektedir.
Son yıllarda yapılan çalışmalarda, ancak, daha iyi kayıt koşulları içinde dar mikro içine aksonlar büyüyebilir uyumlu microelectrodes alarak elde edilebilir göstermiştir. Bu yapılandırma, öyle ki aksonal sinyaller yayma kolayca olabilir7,8,9,10,11,12SNR önemli bir artış tespit sağlar, 13. Bir elektriksel olarak yalıtılmış microenvironment aksonal sinyalleri11yükseltmek uygun mikrosıvısal aygıtları MEA teknolojisi ile İttifakı gayet stratejisi oluşturur. Ayrıca, birden çok algılama microelectrodes bir microgroove boyunca varlığını algılama ve aksonal sinyal yayma karakterizasyonu için esastır.
Böyle vitro platformları ile son derece kontrol edilebilir nöronal ağ Topografyaları birçok araştırma soruları14için adapte edilebilir. Bu platformlar nöronal kültür bağlamında kullanılmak üzere uygundur ama ortak kültür yapılandırmaları, sinir hücreleri ve diğer hücre tipleri arasındaki iletişimi nerede izlenen ve değerlendirildi mühendisi için genişletilebilir. Bu kurulum böylece sinirsel ilgili çalışmaları açıkların, nöronal devreler, bilgi kodlama, ateş ve neuroregeneration gibi bir dizi keşfetmek için çok ilginç koşullar sağlar. Ayrıca, onun insan indüklenmiş pluripotent kök hücreler15,16 ortaya çıkan modelleri ile birlikte yeni yollar sinir sistemini etkiler insan hastalıkları için potansiyel tedavilerin geliştirilmesinde açabilirsiniz.
Laboratuarımıza bu platformu microelectrodes Havacilik (µEF) ile birleştiren cep ve ağ düzeyinde ve onların dolaylı fizyo – ve patolojik sinir sistemi nöronal süreçleri anlamak için kullanıyor. Böyle platformu Nörobilim alanında değeri göz önüne alındığında, bu iletişim kuralının amacını nasıl bölümlere nöronal kültür substrat entegre ölçü üzerinde oluşturmak için göstermektir kültür nöronlar bu platform ve başarılı bir şekilde kayıt nasıl yapılır analiz ve bu deneylerin sonuçlarını yorumlamak. Bu iletişim kuralı kesinlikle sinirsel iletişim çalışmada nöronal kültürler için deneysel araç zenginleştirmek olacak.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada sunulan protokolü nasıl bir mikrosıvısal aygıtı ve bir MEA standart ticari olarak mevcut tasarımları ile oluşan bir µEF montajı ve kaydedilen verileri çözümlemek nasıl gösterir.
Bir deney tasarımı yaparken, araştırmacılar vitro modeli microgroove ayarlamaları kısıtlar MEA sabit kılavuz tarafından sınırlı olduğu dikkate almak gerekir. Belirli mikrosıvısal veya MEA tasarım kullanımı belirli deneysel ihtiyaçlarına bağlı olacaktır ama genel o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser FEDER – yarışmak 2020 yoluyla Fundo Europeu de Desenvolvimento bölgesel para tarafından finanse edildi – Operacional programı için rekabet ve küreselleşme (POCI), Portekiz 2020 ve Portekizce tarafından fon FCT – Fundação para Ciência e bir Teknoloji / Ministério da Ciência, PTDC/CTM-NAN/3146/2014 (POCI-01-0145-FEDER-016623) projesi çerçevesinde teknoloji e Ensino çift. José C Mateus FCT (PD/BD/135491/2018) tarafından desteklenmiştir. Paulo Aguiar Programa Ciência – Programa Operacional Türk Humano (POPH) – promosyon bilimsel istihdam, ESF ve MCTES ve program Investigador FCT, tarafından POPH ve Fundo sosyal Europeu desteklenmiştir. Mikrosıvısal aygıtları INESC – Microsystems ve Nanoteknolojide, Portekiz, João Pedro Conde ve Virginia Chu gözetiminde fabrikasyon.
Materials
| B-27 Suplement (50X) | Thermo Fisher Scientific | LTI17504-044 | |
| Branched poly(ethylene imine) (PEI), 25 kDa | Sigma-Aldrich | 408727 | Purify branched PEI by dialysis using a 2.5 kDa cut-off membrane for 3 days at 4°C against a 5 mM HCl solution (renewed daily). Freeze-dry the purified PEI. |
| Cell strainer (40 µm) | Falcon | 352340 | |
| Conical microtubes (1.5 ml) | VWR | 211-0015 | |
| Disposable diaper, 60×40 cm | Bastos Viegas SA | 455-019 | |
| Forceps Dumont #5, straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Forceps Dumont #5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Forceps Dumont #7, curved | Fine Science Tools | 91197-00 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Premium | Biowest | S181BH-500ML | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | Prepare laminin stock solution at 1 mg/mL by dissolving the powder in the respective volume of non-supplemented medium. Store laminin solution at -20 °C in small aliquots (20 µL) to avoid repeated freeze/thaw cycles. |
| L-Glutamine 200mM | Thermo Fisher Scientific | LTID25030-024 | |
| Neubauer improved counting chamber (hemocytometer) | Marienfeld | 630010 | |
| Neurobasal Medium (1X) | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | Basal medium used for neuronal cultures |
| PDMS microfluidic devices | not applicable | not applicable | Composed of two cell seeding compartments interconnected by 20 microgrooves with 450 μm length × 10 μm height × 14 μm width dimensions and separated by 86 µm (total interspace of 100 μm). |
| Penicillin-streptomycin (P/S) solution (100X) | Biowest | L0022-100 | |
| PES syringe filter unit (Ø 30 mm), 0.22 µm | Frilabo | 1730012 | |
| Polypropylene conical tubes, 15 ml | Thermo Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| Polypropylene conical tubes, 50 ml | Thermo Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 10 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 5 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Standard Regenerated cellulose membrane (2 kDa) | Spectrum labs | 132107 | |
| Standard surgical scissor | Fine Science Tools | 91401-14 | |
| Substrate-integrated planar MEAs (256 microelectrodes) | Multi Channel Systems | 256MEA100/30iR-ITO | 252 titanium nitride (TiN) recording electrodes and 4 internal reference electrodes organized in a 16 by 16 square grid. Each recording electrode is 30 µm in diameter and interspaced by 100 µm. |
| Syringe luer-lock tip, 10 ml | Terumo Europe | 5100-X00V0 | |
| Syringe luer-lock tip, 50 ml | Terumo Europe | 8300006682 | |
| Terg-A-Zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | Enzyme-active powdered detergent used for MEAs cleaning |
| Tissue culture plates, 35 mm | StemCell Technologies | 27150 | |
| Tissue culture plates, 90 mm | Frilabo | 900095 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Trypsin (1:250) | Thermo Fisher Scientific | 27250018 | |
| Vinyl tape 471 | 3M | B40071909 |
References
- Scanziani, M., Hausser, M. Electrophysiology in the age of light. Nature. 461 (7266), 930-939 (2009).
- Nam, Y., Wheeler, B. C. In vitro microelectrode array technology and neural recordings. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39 (1), 45-61 (2011).
- Obien, M. E., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 8, 423 (2014).
- Blau, A. Cell adhesion promotion strategies for signal transduction enhancement in microelectrode array in vitro electrophysiology: An introductory overview and critical discussion. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 18 (5), 481-492 (2013).
- Jones, I. L., et al. The potential of microelectrode arrays and microelectronics for biomedical research and diagnostics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (7), 2313-2329 (2011).
- Bakkum, D. J., et al. Tracking axonal action potential propagation on a high-density microelectrode array across hundreds of sites. Nature Communications. 4, 2181 (2013).
- Claverol-Tinture, E., Cabestany, J., Rosell, X. Multisite recording of extracellular potentials produced by microchannel-confined neurons in vitro. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 54 (2), 331-335 (2007).
- Fitzgerald, J. J., Lacour, S. P., McMahon, S. B., Fawcett, J. W. Microchannels as axonal amplifiers. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 55 (3), 1136-1146 (2008).
- Dworak, B. J., Wheeler, B. C. Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture. Lab on a Chip. 9 (3), 404-410 (2009).
- Morin, F., et al. Constraining the connectivity of neuronal networks cultured on microelectrode arrays with microfluidic techniques: a step towards neuron-based functional chips. Biosensors and Bioelectronics. 21 (7), 1093-1100 (2006).
- Pan, L., et al. Large extracellular spikes recordable from axons in microtunnels. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 22 (3), 453-459 (2014).
- Lewandowska, M. K., Bakkum, D. J., Rompani, S. B., Hierlemann, A. Recording large extracellular spikes in microchannels along many axonal sites from individual neurons. PLoS One. 10 (3), e0118514 (2015).
- Narula, U., et al. Narrow microtunnel technology for the isolation and precise identification of axonal communication among distinct hippocampal subregion networks. PLoS One. 12 (5), e0176868 (2017).
- Forro, C., et al. Modular microstructure design to build neuronal networks of defined functional connectivity. Biosensors and Bioelectronics. 122, 75-87 (2018).
- Frega, M., et al. Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays. Journal of Visualized Experiments. (119), (2017).
- Tukker, A. M., Wijnolts, F. M. J., de Groot, A., Westerink, R. H. S. Human iPSC-derived neuronal models for in vitro neurotoxicity assessment. Neurotoxicology. 67, 215-225 (2018).
- Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on micro-electrode arrays (MEAs). Journal of Visualized Experiments. (39), (2010).
- van Pelt, J., Wolters, P. S., Corner, M. A., Rutten, W. L., Ramakers, G. J. Long-term characterization of firing dynamics of spontaneous bursts in cultured neural networks. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 51 (11), 2051-2062 (2004).
- Wagenaar, D. A., Pine, J., Potter, S. M. An extremely rich repertoire of bursting patterns during the development of cortical cultures. BMC Neuroscience. 7, 11 (2006).
- Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxygen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
- Heiney, K., et al. . μSpikeHunter: An advanced computational tool for the analysis of neuronal communication and action potential propagation in microfluidic platforms. , (2018).
