微电极阵列接口微流体研究神经元通信和轴向信号传播
Summary
该协议旨在说明如何将体外微电极阵列与微流体器件结合起来, 研究神经元培养中的动作电位传递。数据分析, 即传播动作电位的检测和表征, 是使用一种新的先进的、但方便用户和免费提供的计算工具进行的。
Abstract
微电极阵列 (mea) 在体外研究神经元功能方面得到了广泛的应用。这些装置允许同时进行非侵入性记录–长期刺激电生理活动。然而, 当试图了解神经元电路中的通信和信号传播时, 来自每个微电极周围所有来源的信号的传感特性可能会变得不利。在神经元网络中, 多个神经元可以同时激活, 并可以产生重叠的动作电位, 使其难以识别和跟踪信号传播。考虑到这一局限性, 我们建立了一个体外设置, 重点评估电生理通信, 它能够分离和放大具有较高空间和时间分辨率的轴突信号。通过微流体器件和多边环境协定的接口, 我们能够通过轴突和微电极的控制对齐来划分神经元培养。这种设置允许在几个星期的时间里记录具有高信噪比的尖峰传播。结合专门的数据分析算法, 详细地量化了通信相关的几个属性, 如传播速度、传导故障、烧成速率、前品位尖峰和编码机制。
该协议演示了如何在底集成的多边环境协定上创建分隔的神经元培养设置, 如何在此设置中培养神经元, 以及如何成功地记录、分析和解释此类实验的结果。在这里, 我们展示了建立的设置如何简化了对神经元通信和轴突信号传播的理解。这些平台为具有工程和可控神经元网络拓扑的新的体外模型铺平了道路。它们可以在同质神经元培养的背景下使用, 也可以与共培养配置一起使用, 例如, 对感觉神经元和其他细胞类型之间的通信进行监测和评估。这种设置提供了非常有趣的条件来研究, 例如, 神经发育, 神经元电路, 信息编码, 神经退行性变和神经再生的方法。
Introduction
了解神经元回路中的电通信是揭示正常功能的一个基本步骤, 也是解决功能障碍的治疗策略的一个基本步骤。神经元集成、计算和中继沿薄轴突传播的动作电位 (ap)。传统的电生理技术 (如膜片钳) 是研究神经元活动的强大技术, 但通常仅限于较大的细胞结构, 如 soma 或树突。成像技术为研究空间分辨率高的轴突信号提供了一种替代方法, 但在技术上很难执行, 也不允许进行长期测量1。在此背景下, 微电极阵列 (mea) 和微流体技术的结合可以在揭示神经元的基本特性方面做出强有力的贡献, 从而在体外神经元网络中产生活性和信号传输2,(三)有什么问题吗？
mea 技术依赖于神经元培养的细胞外记录。这种电生理方法的主要优点是能够在多个站点以非侵入性方式支持长期、同时刺激和记录.mea 由嵌入在玻璃晶片基板中的生物相容性、高导电性和耐腐蚀微电极制成。它们与传统的细胞培养生物涂层兼容, 通过促进细胞粘附, 显著提高了基材和细胞之间的密封电阻3,4。此外, 它们在设计上用途广泛, 在微电极尺寸、几何形状和密度方面可能有所不同。总体而言, mea 作为常规细胞培养血管发挥作用, 其优点是允许同时进行活体成像和电生理记录/刺激。
mea 技术的应用有助于研究神经网络的重要特征5。然而, 有一些固有的特点限制了多边环境协定在神经元电路中研究通信和 ap 传播的性能。mea 允许从单个细胞甚至子细胞结构 (如轴突) 进行记录, 但与体细胞信号相比, 轴突信号的信噪比 (snr)非常低。此外, 从每个微电极周围的所有来源感知细胞外场电位的特性阻碍了在神经元电路中跟踪信号传播。
然而, 最近的研究表明, 通过在狭窄的微通道内排列微电极, 可以使轴突生长到其中, 从而实现更好的记录条件。此配置显著增加了信噪比, 因此可以很容易地检测到传播轴突信号的 7、8、9、10、11、12、 13岁将微流体器件与 mea 技术结合起来的策略创造了一个适合放大轴突信号11 的电隔离微环境。此外, 沿微槽存在多个传感微电极是检测和表征轴突信号传播的基础。
这种具有高度可控神经元网络拓扑的体外平台可以适应许多研究问题14。这些平台适合在神经元培养的背景下使用, 但可以扩展到工程共培养配置, 在那里可以监测和评估神经元与其他细胞类型之间的通信。因此, 这种设置提供了非常有趣的条件, 以探索一些与神经元有关的研究, 如神经发育, 神经元电路, 信息编码, 神经退行性变和神经再生。此外, 它与新出现的人类诱导多能干细胞模型 15、16结合起来, 可以为开发影响神经系统的人类疾病的潜在疗法开辟新的途径。
我们的实验室正在使用这个将微电极与微流体 (μef) 结合起来的平台来了解细胞和网络水平的神经元过程及其在生理和病理神经系统中的含义。鉴于这种平台在神经科学领域的价值, 本协议的目的是演示如何在俯冲集成的多边环境协定上创建条块分割的神经元培养, 如何在此平台上培养神经元, 以及如何成功记录,分析和解释这些实验的结果。该方案必将丰富神经细胞培养研究的实验工具箱。
Protocol
Representative Results
Discussion
这里介绍的协议演示了如何组装一个μef, 由一个微流体器件和一个具有标准商业可用设计的 mea 组成, 以及如何分析记录的数据。
在设计实验时, 研究人员必须考虑到体外模型受到 mea 固定网格的限制, 这限制了微槽的排列。特定微流体或 mea 设计的使用将取决于特定的实验需要, 但一般来说, 相同的步骤应适用于不同的μf 配置。
在μef 装配之前要做?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作由 feder-fundo eurotin u de desenvolvimento 区域基金通过2020年葡萄牙竞争力和国际化业务方案提供资金, 葡萄牙基金通过 fct-fct-fundaçao para Ciência e a 提供资金。tecnologia/ministério da ciéncia, tecnologia e ensino superior, 在 ptdctm-nan 2014 项目框架内 (pci-0145-feder-016623)。joséc mateus 得到了 fct (pd/bd/1349年) 的支持。paula aguiar 得到了 Ciência—-警察—-促进科学就业、esf 和 mctes 和方案调查人员 fct、peph 和 fundo social eurou 的支持。这些微流体装置是在若昂·佩德罗·孔德和弗吉尼亚·朱的监督下, 在葡萄牙 inesc—-微系统和纳米技术公司制造的。
Materials
| B-27 Suplement (50X) | Thermo Fisher Scientific | LTI17504-044 | |
| Branched poly(ethylene imine) (PEI), 25 kDa | Sigma-Aldrich | 408727 | Purify branched PEI by dialysis using a 2.5 kDa cut-off membrane for 3 days at 4°C against a 5 mM HCl solution (renewed daily). Freeze-dry the purified PEI. |
| Cell strainer (40 µm) | Falcon | 352340 | |
| Conical microtubes (1.5 ml) | VWR | 211-0015 | |
| Disposable diaper, 60×40 cm | Bastos Viegas SA | 455-019 | |
| Forceps Dumont #5, straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Forceps Dumont #5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Forceps Dumont #7, curved | Fine Science Tools | 91197-00 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Premium | Biowest | S181BH-500ML | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | Prepare laminin stock solution at 1 mg/mL by dissolving the powder in the respective volume of non-supplemented medium. Store laminin solution at -20 °C in small aliquots (20 µL) to avoid repeated freeze/thaw cycles. |
| L-Glutamine 200mM | Thermo Fisher Scientific | LTID25030-024 | |
| Neubauer improved counting chamber (hemocytometer) | Marienfeld | 630010 | |
| Neurobasal Medium (1X) | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | Basal medium used for neuronal cultures |
| PDMS microfluidic devices | not applicable | not applicable | Composed of two cell seeding compartments interconnected by 20 microgrooves with 450 μm length × 10 μm height × 14 μm width dimensions and separated by 86 µm (total interspace of 100 μm). |
| Penicillin-streptomycin (P/S) solution (100X) | Biowest | L0022-100 | |
| PES syringe filter unit (Ø 30 mm), 0.22 µm | Frilabo | 1730012 | |
| Polypropylene conical tubes, 15 ml | Thermo Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| Polypropylene conical tubes, 50 ml | Thermo Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 10 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 5 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Standard Regenerated cellulose membrane (2 kDa) | Spectrum labs | 132107 | |
| Standard surgical scissor | Fine Science Tools | 91401-14 | |
| Substrate-integrated planar MEAs (256 microelectrodes) | Multi Channel Systems | 256MEA100/30iR-ITO | 252 titanium nitride (TiN) recording electrodes and 4 internal reference electrodes organized in a 16 by 16 square grid. Each recording electrode is 30 µm in diameter and interspaced by 100 µm. |
| Syringe luer-lock tip, 10 ml | Terumo Europe | 5100-X00V0 | |
| Syringe luer-lock tip, 50 ml | Terumo Europe | 8300006682 | |
| Terg-A-Zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | Enzyme-active powdered detergent used for MEAs cleaning |
| Tissue culture plates, 35 mm | StemCell Technologies | 27150 | |
| Tissue culture plates, 90 mm | Frilabo | 900095 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Trypsin (1:250) | Thermo Fisher Scientific | 27250018 | |
| Vinyl tape 471 | 3M | B40071909 |
References
- Scanziani, M., Hausser, M. Electrophysiology in the age of light. Nature. 461 (7266), 930-939 (2009).
- Nam, Y., Wheeler, B. C. In vitro microelectrode array technology and neural recordings. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39 (1), 45-61 (2011).
- Obien, M. E., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 8, 423 (2014).
- Blau, A. Cell adhesion promotion strategies for signal transduction enhancement in microelectrode array in vitro electrophysiology: An introductory overview and critical discussion. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 18 (5), 481-492 (2013).
- Jones, I. L., et al. The potential of microelectrode arrays and microelectronics for biomedical research and diagnostics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (7), 2313-2329 (2011).
- Bakkum, D. J., et al. Tracking axonal action potential propagation on a high-density microelectrode array across hundreds of sites. Nature Communications. 4, 2181 (2013).
- Claverol-Tinture, E., Cabestany, J., Rosell, X. Multisite recording of extracellular potentials produced by microchannel-confined neurons in vitro. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 54 (2), 331-335 (2007).
- Fitzgerald, J. J., Lacour, S. P., McMahon, S. B., Fawcett, J. W. Microchannels as axonal amplifiers. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 55 (3), 1136-1146 (2008).
- Dworak, B. J., Wheeler, B. C. Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture. Lab on a Chip. 9 (3), 404-410 (2009).
- Morin, F., et al. Constraining the connectivity of neuronal networks cultured on microelectrode arrays with microfluidic techniques: a step towards neuron-based functional chips. Biosensors and Bioelectronics. 21 (7), 1093-1100 (2006).
- Pan, L., et al. Large extracellular spikes recordable from axons in microtunnels. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 22 (3), 453-459 (2014).
- Lewandowska, M. K., Bakkum, D. J., Rompani, S. B., Hierlemann, A. Recording large extracellular spikes in microchannels along many axonal sites from individual neurons. PLoS One. 10 (3), e0118514 (2015).
- Narula, U., et al. Narrow microtunnel technology for the isolation and precise identification of axonal communication among distinct hippocampal subregion networks. PLoS One. 12 (5), e0176868 (2017).
- Forro, C., et al. Modular microstructure design to build neuronal networks of defined functional connectivity. Biosensors and Bioelectronics. 122, 75-87 (2018).
- Frega, M., et al. Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays. Journal of Visualized Experiments. (119), (2017).
- Tukker, A. M., Wijnolts, F. M. J., de Groot, A., Westerink, R. H. S. Human iPSC-derived neuronal models for in vitro neurotoxicity assessment. Neurotoxicology. 67, 215-225 (2018).
- Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on micro-electrode arrays (MEAs). Journal of Visualized Experiments. (39), (2010).
- van Pelt, J., Wolters, P. S., Corner, M. A., Rutten, W. L., Ramakers, G. J. Long-term characterization of firing dynamics of spontaneous bursts in cultured neural networks. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 51 (11), 2051-2062 (2004).
- Wagenaar, D. A., Pine, J., Potter, S. M. An extremely rich repertoire of bursting patterns during the development of cortical cultures. BMC Neuroscience. 7, 11 (2006).
- Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxygen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
- Heiney, K., et al. . μSpikeHunter: An advanced computational tool for the analysis of neuronal communication and action potential propagation in microfluidic platforms. , (2018).
