Interfaçage Microfluidics microélectrode tableaux pour étudier la Communication neuronale et la Propagation des signaux axonale
Summary
Ce protocole vise à démontrer comment combiner in vitro les baies de la microélectrode avec dispositifs microfluidiques pour étudier la transmission du potentiel d’action dans les cultures de neurones. Analyse des données, à savoir la détection et la caractérisation des potentiels d’action, de la multiplication est effectuée en utilisant une nouvelle avancée, pourtant facile à utiliser et disponible gratuitement, outil de calcul.
Abstract
Matrices de Microélectrodes (AME) sont largement utilisés pour étudier la fonction neuronale in vitro. Ces dispositifs vont permettre simultanée non invasif enregistrement/stimulation de l’activité électrophysiologique pendant de longues périodes. Toutefois, la propriété de détection des signaux de toutes les sources autour de chaque microélectrode peut devenir défavorable en essayant de comprendre la communication et de propagation dans les circuits neuronaux de signaux. Dans un réseau neuronal, plusieurs neurones peuvent être activés simultanément et peuvent générer des potentiels d’action qui se chevauchent, rendant difficile de discriminer et de suivre la propagation du signal. Compte tenu de cette limitation, nous avons établi une configuration en vitro axée sur l’évaluation électrophysiologique communication, qui est capable d’isoler et d’amplifier les signaux axonales avec une haute résolution spatiale et temporelle. En interfaçant dispositifs microfluidiques et l’ame, nous sommes capables à compartimenter les cultures de neurones avec un alignement bien contrôlé des axones et des Microélectrodes. Cette configuration permet aux enregistrements de la propagation de pointe avec un rapport signal sur bruit élevé au cours de plusieurs semaines. Combiné avec des algorithmes d’analyse de données spécialisées, il fournit quantification détaillée de plusieurs communication associés à des propriétés telles que la vitesse de propagation, défaut de conduction, taux de décharge, antérograde des pointes et des mécanismes de codage.
Ce protocole montre comment créer une configuration neuronale compartimentée de la culture sur substrat intégré ame, comment la culture de neurones dans cette configuration et comment correctement enregistrer, analyser et interpréter les résultats de ces expériences. Ici, nous montrons comment la configuration établie simplifie la compréhension de la communication neuronale et de propagation des signaux axonale. Ces plates-formes ouvrent la voie à nouveaux modèles in vitro avec topographies de réseau neuronal machiné et contrôlables. Il peuvent être utilisés dans le contexte des cultures de neurones homogènes, ou avec des configurations de culture mixte où, par exemple, la communication entre les neurones sensoriels et autres types de cellules est surveillée et évaluée. Cette configuration offre des conditions très intéressantes à étudier, par exemple, les troubles du développement neurologique, des circuits neuronaux, information de codage, approches neurodégénérescence et neurorégénération.
Introduction
Comprendre la communication électrique dans les circuits neuronaux est une étape fondamentale pour révéler une fonction normale et élaborer des stratégies thérapeutiques pour traiter la dysfonction. Neurones, intègrent, calculer et relayer les potentiels d’action (PA) qui se propagent le long de leur axone mince. Techniques électrophysiologiques traditionnelles (p. ex., patch clamp de) sont des techniques puissantes pour étudier l’activité neuronale, mais ne se limitent souvent à plus grandes structures cellulaires, tels que le soma ou les dendrites. Techniques d’imagerie offrent une alternative pour étudier les signaux axonales avec haute résolution spatiale, mais ils sont techniquement difficiles à réaliser et ne permettent pas de mesures à long terme1. Dans ce contexte, la combinaison de la microélectrode tableaux (AME) et microfluidique peut apporter une contribution puissante en révélant les propriétés fondamentales des neuron´s transmission de signal et de l’activité au sein de réseaux de neurones in vitro2 , 3.
AME technologie repose sur des enregistrements extracellulaires des cultures de neurones. Les principaux avantages de cette méthodologie électrophysiologique sont sa capacité à supporter une stimulation à long terme, simultanée et enregistrement sur plusieurs sites et un moyen non invasif3. Ame est faits de Microélectrodes conductrices et résistant à la corrosion biocompatibles, hautes incorporées dans un support de plaquette de verre. Ils sont compatibles avec la culture cellulaire conventionnel bio-revêtements, qui, en promouvant l’adhésion cellulaire significativement augmentent la résistance à l’étanchéité entre le substrat et cellules3,4. En outre, ils sont polyvalents dans la conception et peuvent varier en taille de Microélectrodes, la géométrie et la densité. Dans l’ensemble, ame fonctionne comme les récipients de culture de cellules classiques avec l’avantage de permettre la stimulation/enregistrements live-imagerie et électrophysiologique simultanée.
L’utilisation de la technologie de la MEA a contribué à l’étude des caractéristiques importantes des réseaux neuronaux5. Cependant, il y a des caractéristiques intrinsèques qui limitent les performances des ame pour l’étude de communication et propagation de l’APs dans un circuit neuronal. Ame permettre des enregistrements de cellules individuelles et même subcellulaires structures telles que les axones, mais par rapport aux signaux somal, axonales signaux ont un très faible rapport signal-bruit (RSB)6. En outre, la caractéristique de détection des potentiels de domaine extracellulaire de toutes provenances autour de chaque microélectrode entrave le suivi de la propagation des signaux dans un circuit neuronal.
Toutefois, des études récentes ont démontré que les meilleures conditions d’enregistrement est possible en ayant les Microélectrodes alignés dans l’étroit microcanaux dans lesquels les axones peuvent se développer. Cette configuration permet une augmentation significative de la SNR, tel que la multiplication des signaux axonales peut être facilement détecté7,8,9,10,11,12, 13. La stratégie d’alliant dispositifs microfluidiques avec technologie MEA crée un micro-environnement isolé électriquement adapté pour amplifier les signaux axonale11. En outre, la présence de multiples Microélectrodes télédétection le long d’un microsillon est fondamentale pour la détection et la caractérisation de la propagation des signaux axonale.
Ces plates-formes in vitro avec topographies de réseau neuronal très contrôlable peuvent être adaptés à beaucoup de questions de recherche14. Ces plates-formes sont apte à être utilisé dans le contexte des cultures de neurones, mais peuvent être étendus pour l’ingénieur de configurations de culture mixte, où la communication entre les neurones et d’autres types de cellules peut être surveillée et évaluée. Cette configuration fournit donc des conditions très intéressantes d’explorer un certain nombre d’études neural liées telles que le développement neurologique, circuits neuronaux, codage de l’information, la neurodégénérescence et neurorégénération. En outre, sa combinaison avec les modèles émergents de15,des cellules souches humaines pluripotentes induites16 peut ouvrir de nouvelles avenues dans le développement de traitements potentiels pour les maladies humaines qui affectent le système nerveux.
Notre laboratoire utilise cette plate-forme alliant Microélectrodes microfluidics (µEF) pour comprendre les processus neuronaux au niveau cellulaire et réseau et leur implication dans la physio – et pathologique du système nerveux. Compte tenu de la valeur de cette plateforme dans le domaine des neurosciences, le but du présent protocole est de démontrer comment créer une culture de neurones compartimentée sur substrat intégré ame, comment les neurones de la culture dans cette plateforme et comment faire pour enregistrer avec succès, analyser et interpréter les résultats de ces expériences. Ce protocole va certainement enrichir la boîte à outils expérimentaux pour les cultures de neurones dans l’étude de la communication neuronale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole présenté ici montre comment assembler un µEF, composé d’un dispositif microfluidique et un MEA avec des conceptions standards disponible dans le commerce et analyser les données enregistrées.
Lorsque vous concevez une expérience, les chercheurs doivent tenir compte du fait que le modèle in vitro est limité par la grille fixe MEA, qui contraint les arrangements de microsillons. L’utilisation d’un particulier microfluidique ou conception MEA dépendra des bes…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par le FEDER – Fundo Europeu de Desenvolvimento fonds régionaux par le biais de la COMPETE 2020 – finance les Operacional de Programme pour la compétitivité et l’Internationalisation (POCI), Portugal 2020 et par les portugais à FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia / Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior dans le cadre du projet PTDC/CTM-NAN/3146/2014 (POCI-01-0145-FEDER-016623). José C Mateus a été appuyée par la CFPI (PD/BD/135491/2018). Paulo Aguiar a été appuyée par Programa Ciência – Humano de Potencial de Programa Operacional (POPH) – Promotion de l’emploi scientifique, du FSE et MCTES et programme Investigador FCT, POPH et Fundo Social Europeu. Les dispositifs microfluidiques ont été fabriqués à l’INESC – microsystèmes et Nanotechnologies (Portugal), sous la supervision de João Pedro Conde et Virginia Chu.
Materials
| B-27 Suplement (50X) | Thermo Fisher Scientific | LTI17504-044 | |
| Branched poly(ethylene imine) (PEI), 25 kDa | Sigma-Aldrich | 408727 | Purify branched PEI by dialysis using a 2.5 kDa cut-off membrane for 3 days at 4°C against a 5 mM HCl solution (renewed daily). Freeze-dry the purified PEI. |
| Cell strainer (40 µm) | Falcon | 352340 | |
| Conical microtubes (1.5 ml) | VWR | 211-0015 | |
| Disposable diaper, 60×40 cm | Bastos Viegas SA | 455-019 | |
| Forceps Dumont #5, straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Forceps Dumont #5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Forceps Dumont #7, curved | Fine Science Tools | 91197-00 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Premium | Biowest | S181BH-500ML | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | Prepare laminin stock solution at 1 mg/mL by dissolving the powder in the respective volume of non-supplemented medium. Store laminin solution at -20 °C in small aliquots (20 µL) to avoid repeated freeze/thaw cycles. |
| L-Glutamine 200mM | Thermo Fisher Scientific | LTID25030-024 | |
| Neubauer improved counting chamber (hemocytometer) | Marienfeld | 630010 | |
| Neurobasal Medium (1X) | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | Basal medium used for neuronal cultures |
| PDMS microfluidic devices | not applicable | not applicable | Composed of two cell seeding compartments interconnected by 20 microgrooves with 450 μm length × 10 μm height × 14 μm width dimensions and separated by 86 µm (total interspace of 100 μm). |
| Penicillin-streptomycin (P/S) solution (100X) | Biowest | L0022-100 | |
| PES syringe filter unit (Ø 30 mm), 0.22 µm | Frilabo | 1730012 | |
| Polypropylene conical tubes, 15 ml | Thermo Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| Polypropylene conical tubes, 50 ml | Thermo Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 10 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 5 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Standard Regenerated cellulose membrane (2 kDa) | Spectrum labs | 132107 | |
| Standard surgical scissor | Fine Science Tools | 91401-14 | |
| Substrate-integrated planar MEAs (256 microelectrodes) | Multi Channel Systems | 256MEA100/30iR-ITO | 252 titanium nitride (TiN) recording electrodes and 4 internal reference electrodes organized in a 16 by 16 square grid. Each recording electrode is 30 µm in diameter and interspaced by 100 µm. |
| Syringe luer-lock tip, 10 ml | Terumo Europe | 5100-X00V0 | |
| Syringe luer-lock tip, 50 ml | Terumo Europe | 8300006682 | |
| Terg-A-Zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | Enzyme-active powdered detergent used for MEAs cleaning |
| Tissue culture plates, 35 mm | StemCell Technologies | 27150 | |
| Tissue culture plates, 90 mm | Frilabo | 900095 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Trypsin (1:250) | Thermo Fisher Scientific | 27250018 | |
| Vinyl tape 471 | 3M | B40071909 |
References
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