Interfacing mikrofluidik med mikroelektrode Arrays til at studere Neuronal kommunikation og cytoskeletale Signal formering
Summary
Denne protokol har til formål at demonstrere, hvordan man kombinere i vitro mikroelektrode arrays med mikrofluid enheder til at studere aktionspotentialet transmission i neuronal kulturer. Dataanalyse, nemlig påvisning og karakterisering af prydplanteformeringsmateriale aktion potentialer, er udført ved hjælp af en ny avanceret, men brugervenlig og frit tilgængelige, computational værktøj.
Abstract
Mikroelektrode arrays (MMA) er almindeligt anvendt til at studere neuronal funktion i vitro. Disse enheder tillade samtidige non-invasiv optagelse/stimulation af elektrofysiologiske aktivitet i lange perioder. Egenskaben for sensing signaler fra alle kilder omkring hver mikroelektrode kan imidlertid blive ugunstige når de forsøger at forstå kommunikation og signalere formering i neuronal kredsløb. I et neuronal netværk, flere neuroner kan aktiveres samtidig og kan generere overlappende handling potentialer, hvilket gør det vanskeligt at skelne og spore signal formering. I betragtning af denne begrænsning, har vi etableret en in vitro- setup fokuseret på vurderingen af elektrofysiologiske kommunikation, som er i stand til at isolere og forstærke cytoskeletale signaler med høj rumlige og tidsmæssige opløsning. Af en grænseflade mikrofluid enheder og multilaterale miljøaftaler, kan vi inddeler neuronal kulturer med en velkontrollerede justering af axoner og microelectrodes. Denne konfiguration giver mulighed for optagelser af spike formering med en høj signal-støj-forholdet i løbet af flere uger. Kombineret med specialiseret data analyse algoritmer, det giver detaljerede kvantificering af flere kommunikation relaterede egenskaber såsom formering hastighed, overledning fiasko, fyring sats, anterograd pigge, og kodning mekanismer.
Denne protokol viser, hvordan du opretter en opdelte neuronal kultur opsætning via substrat-integreret multilaterale miljøaftaler, sådan kultur neuroner i denne opsætning, og hvordan at registrere, analysere og fortolke resultaterne fra sådanne eksperimenter. Vi viser her, hvordan den etablerede setup forenkler forståelse af neuronal kommunikation og cytoskeletale signal formering. Disse platforme bane vejen for nye in vitro- modeller med manipuleret og kontrollerbar neuronal netværk topografi. De kan bruges i forbindelse med homogene neuronal kulturer eller med fælles kultur konfigurationer hvor, for eksempel, kommunikation mellem sensoriske neuroner og andre celletyper er overvåget og vurderet. Denne opsætning giver meget interessante betingelser at studere, for eksempel, forstyrrelser i nervesystemets udvikling, neuronal kredsløb, information kodning, neurodegeneration og neuroregeneration tilgange.
Introduction
Forstå elektrisk kommunikation i neuronal kredsløb er et afgørende skridt til at afsløre normale funktion, og udarbejde terapeutiske strategier til at løse dysfunktion. Neuroner integrere, beregne og relæ handling potentialer (APs) som udbrede langs deres tynde axoner. Traditionelle elektrofysiologiske teknikker (fx patch klemme) er kraftfulde teknikker til at studere neuronal aktivitet, men er ofte begrænset til de større cellulære strukturer, såsom soma eller dendritter. Billedbehandling teknikker tilbyde et alternativ til at studere cytoskeletale signaler med stor rumlig opløsning, men de er teknisk vanskeligt at udføre og ikke tillader langsigtede mål1. I denne sammenhæng, kan kombinationen af mikroelektrode arrays (MMA) og mikrofluidik yde et stærkt bidrag i afslørende de grundlæggende egenskaber for neuron´s aktivitet og signal transmission inden for neuronal netværk in vitro-2 , 3.
MEA teknologi bygger på ekstracellulære optagelser af neuronal kulturer. De vigtigste fordele ved denne elektrofysiologiske metoder er dens evne til at støtte langsigtede, samtidige stimulation og optagelse på flere steder og i en ikke-invasiv måde3. MMA er lavet af biokompatible, høj ledende og korrosionsbestandig microelectrodes indlejret i et glas wafer substrat. De er kompatible med konventionel celle kultur bio-belægninger, som ved at fremme celle friktion betydeligt øger den forsegling modstand mellem substrat og celler3,4. Derudover er de alsidige i design og kan variere i microelectrodes størrelse, geometri og tæthed. Samlet set arbejde MEAs som konventionel celle kultur fartøjer med fordelen, at samtidige live imaging og elektrofysiologiske optagelser/stimulation.
Brugen af MEA teknologi har bidraget til studiet af vigtige funktioner af neurale netværk5. Men der er iboende egenskaber, der begrænser udførelsen af multilaterale miljøaftaler for at studere kommunikation og APs formering i et neuronal kredsløb. MEAs aktiverer optagelser fra enkelt celler og endda subcellulært strukturer som axoner, men i forhold til somal signaler, cytoskeletale signaler har et meget lavt signal / støj-forhold (SNR)6. Endvidere hæmmer karakteristisk for sensing ekstracellulære felt potentialer fra alle kilder omkring hver mikroelektrode sporing af signal formering i et neuronal kredsløb.
Nylige undersøgelser har imidlertid vist, at bedre optagelse betingelser kan opnås ved at have de microelectrodes linje inden for snævre microchannels, hvori axoner kan vokse. Denne konfiguration giver en betydelig stigning i SNR sådan at formerings cytoskeletale signaler kan være let fundet7,8,9,10,11,12, 13. Strategien for allierer mikrofluid enheder med MEA teknologi skaber en elektrisk isoleret mikromiljø egnet til at forstærke cytoskeletale signaler11. Tilstedeværelsen af flere sensing microelectrodes langs en microgroove er desuden afgørende for påvisning og karakterisering af cytoskeletale signal propagation.
Sådanne in vitro- platforme med meget styrbar neuronal netværk topografi kan tilpasses til mange forskning spørgsmål14. Disse platforme er egnede til at blive brugt i forbindelse med neuronal kulturer men kan udvides til Engineering Co kultur konfigurationer, hvor kommunikationen mellem neuroner og andre celletyper kan overvåges og vurderes. Denne opsætning giver således meget interessante betingelser at udforske en række neurale-relaterede studier som forstyrrelser i nervesystemets udvikling, neuronal kredsløb, information kodning, neurodegeneration og neuroregeneration. Derudover kan kombination med nye modeller af menneskelige inducerede pluripotente stamceller15,16 åbne nye veje i udviklingen af potentielle terapier for menneskelige sygdomme, der påvirker nervesystemet.
Vores laboratorium bruger denne platform kombinerer microelectrodes med mikrofluidik (µEF) for at forstå neuronal processer på det cellulære og netværket niveau og deres konsekvenser i fysio- og patologiske nervesystem. Da værdien af sådanne platform inden for neuroscience, formålet med denne protokol er at vise, hvordan du opretter en opdelte neuronal kultur over substrat-integreret MEAs, hvordan kultur neuroner i denne platform og hvordan man med held optage, analysere og fortolke resultaterne fra sådanne eksperimenter. Denne protokol vil helt sikkert berige den eksperimentelle værktøjskasse til neuronal kulturer i studiet af neurale kommunikation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen præsenteres her viser hvordan man samler et µEF, bestående af en mikrofluid enhed og et MEA med standard kommercielt tilgængelige designs, og hvordan man analysere de registrerede data.
Når du udformer et eksperiment, skal forskere tage hensyn, in vitro- model er begrænset af MEA fast gitter, der begrænser microgroove ordninger. Brugen af en bestemt mikrofluid eller MEA design vil afhænge af de specifikke eksperimentelle behov, men generelt er de samme trin som pro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev finansieret af EFRU – Fundo Europeu de Desenvolvimento regionale midler gennem konkurrere 2020 – Operacional program for konkurrenceevne, og internationalisering (POCI), Portugal 2020, og af portugisiske midler gennem FCT – Fundação para en Ciência e en Tecnologia / Ministério da Ciência, Tecnologia e nederlandsksprogede Superior inden for rammerne af projektet PTDC/CTM-NAN/3146/2014 (POCI-01-0145-FEDER-016623). José C Mateus blev støttet af FCT (PD/BD/135491/2018). Paulo Aguiar blev støttet af Programa Ciência – Programa Operacional Potencial system (POPH) – fremme af videnskabelige beskæftigelse, ESF og MCTES og programmet Investigador FCT, POPH og Fundo Social Europeu. Mikrofluid enheder blev fremstillet på INESC – Microsystems og nanoteknologi, Portugal, under tilsyn af João Pedro Conde og Virginia Chu.
Materials
| B-27 Suplement (50X) | Thermo Fisher Scientific | LTI17504-044 | |
| Branched poly(ethylene imine) (PEI), 25 kDa | Sigma-Aldrich | 408727 | Purify branched PEI by dialysis using a 2.5 kDa cut-off membrane for 3 days at 4°C against a 5 mM HCl solution (renewed daily). Freeze-dry the purified PEI. |
| Cell strainer (40 µm) | Falcon | 352340 | |
| Conical microtubes (1.5 ml) | VWR | 211-0015 | |
| Disposable diaper, 60×40 cm | Bastos Viegas SA | 455-019 | |
| Forceps Dumont #5, straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Forceps Dumont #5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Forceps Dumont #7, curved | Fine Science Tools | 91197-00 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Premium | Biowest | S181BH-500ML | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | Prepare laminin stock solution at 1 mg/mL by dissolving the powder in the respective volume of non-supplemented medium. Store laminin solution at -20 °C in small aliquots (20 µL) to avoid repeated freeze/thaw cycles. |
| L-Glutamine 200mM | Thermo Fisher Scientific | LTID25030-024 | |
| Neubauer improved counting chamber (hemocytometer) | Marienfeld | 630010 | |
| Neurobasal Medium (1X) | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | Basal medium used for neuronal cultures |
| PDMS microfluidic devices | not applicable | not applicable | Composed of two cell seeding compartments interconnected by 20 microgrooves with 450 μm length × 10 μm height × 14 μm width dimensions and separated by 86 µm (total interspace of 100 μm). |
| Penicillin-streptomycin (P/S) solution (100X) | Biowest | L0022-100 | |
| PES syringe filter unit (Ø 30 mm), 0.22 µm | Frilabo | 1730012 | |
| Polypropylene conical tubes, 15 ml | Thermo Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| Polypropylene conical tubes, 50 ml | Thermo Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 10 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 5 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Standard Regenerated cellulose membrane (2 kDa) | Spectrum labs | 132107 | |
| Standard surgical scissor | Fine Science Tools | 91401-14 | |
| Substrate-integrated planar MEAs (256 microelectrodes) | Multi Channel Systems | 256MEA100/30iR-ITO | 252 titanium nitride (TiN) recording electrodes and 4 internal reference electrodes organized in a 16 by 16 square grid. Each recording electrode is 30 µm in diameter and interspaced by 100 µm. |
| Syringe luer-lock tip, 10 ml | Terumo Europe | 5100-X00V0 | |
| Syringe luer-lock tip, 50 ml | Terumo Europe | 8300006682 | |
| Terg-A-Zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | Enzyme-active powdered detergent used for MEAs cleaning |
| Tissue culture plates, 35 mm | StemCell Technologies | 27150 | |
| Tissue culture plates, 90 mm | Frilabo | 900095 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Trypsin (1:250) | Thermo Fisher Scientific | 27250018 | |
| Vinyl tape 471 | 3M | B40071909 |
References
- Scanziani, M., Hausser, M. Electrophysiology in the age of light. Nature. 461 (7266), 930-939 (2009).
- Nam, Y., Wheeler, B. C. In vitro microelectrode array technology and neural recordings. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39 (1), 45-61 (2011).
- Obien, M. E., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 8, 423 (2014).
- Blau, A. Cell adhesion promotion strategies for signal transduction enhancement in microelectrode array in vitro electrophysiology: An introductory overview and critical discussion. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 18 (5), 481-492 (2013).
- Jones, I. L., et al. The potential of microelectrode arrays and microelectronics for biomedical research and diagnostics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (7), 2313-2329 (2011).
- Bakkum, D. J., et al. Tracking axonal action potential propagation on a high-density microelectrode array across hundreds of sites. Nature Communications. 4, 2181 (2013).
- Claverol-Tinture, E., Cabestany, J., Rosell, X. Multisite recording of extracellular potentials produced by microchannel-confined neurons in vitro. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 54 (2), 331-335 (2007).
- Fitzgerald, J. J., Lacour, S. P., McMahon, S. B., Fawcett, J. W. Microchannels as axonal amplifiers. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 55 (3), 1136-1146 (2008).
- Dworak, B. J., Wheeler, B. C. Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture. Lab on a Chip. 9 (3), 404-410 (2009).
- Morin, F., et al. Constraining the connectivity of neuronal networks cultured on microelectrode arrays with microfluidic techniques: a step towards neuron-based functional chips. Biosensors and Bioelectronics. 21 (7), 1093-1100 (2006).
- Pan, L., et al. Large extracellular spikes recordable from axons in microtunnels. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 22 (3), 453-459 (2014).
- Lewandowska, M. K., Bakkum, D. J., Rompani, S. B., Hierlemann, A. Recording large extracellular spikes in microchannels along many axonal sites from individual neurons. PLoS One. 10 (3), e0118514 (2015).
- Narula, U., et al. Narrow microtunnel technology for the isolation and precise identification of axonal communication among distinct hippocampal subregion networks. PLoS One. 12 (5), e0176868 (2017).
- Forro, C., et al. Modular microstructure design to build neuronal networks of defined functional connectivity. Biosensors and Bioelectronics. 122, 75-87 (2018).
- Frega, M., et al. Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays. Journal of Visualized Experiments. (119), (2017).
- Tukker, A. M., Wijnolts, F. M. J., de Groot, A., Westerink, R. H. S. Human iPSC-derived neuronal models for in vitro neurotoxicity assessment. Neurotoxicology. 67, 215-225 (2018).
- Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on micro-electrode arrays (MEAs). Journal of Visualized Experiments. (39), (2010).
- van Pelt, J., Wolters, P. S., Corner, M. A., Rutten, W. L., Ramakers, G. J. Long-term characterization of firing dynamics of spontaneous bursts in cultured neural networks. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 51 (11), 2051-2062 (2004).
- Wagenaar, D. A., Pine, J., Potter, S. M. An extremely rich repertoire of bursting patterns during the development of cortical cultures. BMC Neuroscience. 7, 11 (2006).
- Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxygen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
- Heiney, K., et al. . μSpikeHunter: An advanced computational tool for the analysis of neuronal communication and action potential propagation in microfluidic platforms. , (2018).
