Gränssnitt mikrofluidik med mikroelektrod matriser för att studera Neuronal kommunikation och Axonal signalen förökning
Summary
Detta protokoll syftar till att demonstrera hur man kombinerar i vitro mikroelektrod matriser med mikroflödessystem enheter för att studera potentiella åtgärder överföring i neuronala kulturer. Dataanalys, nämligen upptäckt och karakterisering av förökningsmaterial handlingspänningar, är utförda med en ny avancerad, men ändå användarvänliga och fritt tillgängliga, computational verktyg.
Abstract
Mikroelektrod matriser (MEAs) används allmänt att studera nervcellernas funktion i vitro. Dessa enheter kan samtidiga icke-invasiv inspelning/stimulering av elektrofysiologiska aktivitet under långa perioder. Egenskapen för avkänning signaler från alla källor runt varje mikroelektrod kan dock bli unfavorable när man försöker förstå kommunikation och signalen förökning i neuronala kretsar. I ett neuronala nätverk, flera nervceller kan aktiveras samtidigt och kan skapa överlappande handlingspänningar, vilket gör det svårt att diskriminera och spåra signalen förökning. Med tanke på denna begränsning, har vi etablerat en in vitro- setup inriktad på att bedöma elektrofysiologiska kommunikation, som kunna isolera och förstärka axonal signaler med hög rumsliga och temporal upplösning. Av gränssnitt mikroflödessystem enheter och multilaterala miljöavtal, kan vi kategoriserar neuronala kulturer med en väl kontrollerad anpassning av axoner och mikroelektroder. Denna inställning tillåter inspelningar av spike förökning med högt signal-brus-förhållande under loppet av flera veckor. Kombinerat med specialiserade data analys algoritmer, det ger detaljerad kvantifiering av flera kommunikation relaterade egenskaper såsom förökning velocity, överledning misslyckande, eldhastighet, anterograd spikar och kodning mekanismer.
Detta protokoll visar hur man skapar en konkurrensbetingat neuronala kultur setup över substrat-integrerade åtgärder, hur kultur nervceller i den här installationen och hur man framgångsrikt registrera, analysera och tolka resultaten från sådana experiment. Här visar vi hur den etablerade setup förenklar förståelsen av neuronal kommunikation och axonal signalen förökning. Dessa plattformar bana väg för nya in vitro- modeller med konstruerade och kontrollerbar neuronala nätverk kretsmönster. De kan användas i samband med homogena neuronala kulturer, eller med samtidig kultur konfigurationer där, till exempel kommunikation mellan sensoriska neuroner och andra celltyper är övervakas och bedömas. Denna inställning ger mycket intressant förutsättningar att studera, till exempel nervsystemets utveckling, neuronala kretsar, information kodning, neurodegeneration och neuroregeneration strategier.
Introduction
Förstå elektrisk kommunikation i neuronala kretsar är ett grundläggande steg för att avslöja normala funktion, och utforma terapeutiska strategier för att hantera dysfunktion. Nervceller integrera, beräkna och relä handlingspänningar (APs) som sprids längs deras tunna axoner. Traditionella elektrofysiologiska tekniker (t.ex. patch clamp) är kraftfulla tekniker för att studera neuronal aktivitet men är ofta begränsade till de största cellulära strukturerna, såsom soma eller dendriter. Imaging tekniker erbjuder ett alternativ för att studera axonal signaler med hög rumslig upplösning, men de är tekniskt svåra att utföra och inte tillåter långsiktiga mätningar1. I detta sammanhang kan kombinationen av mikroelektrod matriser (åtgärder) och mikrofluidik göra ett kraftfullt bidrag i att avslöja de grundläggande egenskaperna för neuron´s aktivitet och signalerar överföringen inom neuronala nätverk in vitro-2 , 3.
MEA teknik bygger på extracellulära inspelningar av neuronala kulturer. De främsta fördelarna med denna Elektrofysiologisk metodik är dess förmåga att stödja långsiktiga, samtidig stimulering och inspelning på flera platser och i en icke-invasiv sätt3. Mätningar är gjorda av biokompatibel, hög konduktiv och korrosionsbeständig mikroelektroder inbäddade i ett glassubstrat wafer. De är kompatibla med konventionella cell kultur bio-beläggningar, som genom att främja celladhesion avsevärt ökar tätning motståndet mellan substratet och celler3,4. Dessutom, de är mångsidiga i design och kan variera i mikroelektroder storlek, geometri och densitet. Sammantaget arbetar MEAs som konventionella cell odlingskärl med fördelen av att samtidiga live-imaging och elektrofysiologiska recordings/stimulering.
Användningen av MEA-teknik har bidragit till studiet av viktiga funktioner av neurala nätverk5. Dock finns det inneboende funktioner som begränsar prestanda för åtgärder för att studera kommunikation och APs förökning i en neuronal krets. MEAs aktivera inspelningar från enstaka celler och även subcellulära strukturer som axoner, men jämfört med somal signaler, axonal signaler har en mycket låg signal-brus-förhållande (SNR)6. Dessutom hämmar kännetecken av avkänning extracellulära fältet potentialer från alla källor runt varje mikroelektrod spårning av signalen förökning i en neuronal krets.
Nyligen genomförda studier har visat, dock att bättre inspelning villkor kan uppnås genom att ha de mikroelektroder linje inom smala mikrokanaler som axoner kan växa. Den här konfigurationen ger en betydande ökning av SNR så att förökningsmaterial axonal signaler kan vara enkelt upptäckt7,8,9,10,11,12, 13. Strategin att förena mikroflödessystem enheter med MEA teknik skapar ett elektriskt isolerad närmiljön lämpar sig att förstärka axonal signaler11. Dessutom, närvaron av flera fjärranalys mikroelektroder längs en microgroove är grundläggande för identifiering och karakterisering av axonal signalen förökning.
Sådana in vitro- plattformar med mycket kontrollerbar neuronala nätverk kretsmönster kan anpassas till många forskning frågor14. Dessa plattformar är lämplig att användas i samband med neuronala kulturer men kan utökas för att ingenjör samtidig kultur konfigurationer, där kommunikationen mellan nervceller och andra celltyper kan övervakas och bedömas. Denna inställning ger således mycket intressant förutsättningar att utforska ett antal neurala-relaterade studier såsom neuroutvecklingssjukdomar, neuronala kretsar, Informationskodning, neurodegeneration och neuroregeneration. Dessutom kan dess kombination med nya modeller av mänsklig inducerade pluripotenta stamceller15,16 öppna nya vägar i utvecklingen av potentiella behandlingar för mänskliga sjukdomar som påverkar nervsystemet.
Vårt labb använder denna plattform som kombinerar mikroelektroder med mikrofluidik (µEF) för att förstå neurologiska processer på cellulär och nätverk och deras implikation i FYSIO- och patologisk nervsystemet. Med tanke på värdet av sådan plattform inom neurovetenskap, syftet med detta protokoll är att demonstrera hur att skapa en konkurrensbetingat neuronala kultur över substrat-integrerade åtgärder, hur man kultur nervceller i denna plattform och hur man framgångsrikt rekord, analysera och tolka resultaten från sådana experiment. Detta protokoll kommer säkerligen att berika experimentella verktygslådan för neuronala kulturer i studien av neural kommunikation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det protokoll som presenteras här visar hur man monterar en µEF, består av en mikroflödessystem enhet och en MEA med kommersiellt tillgängliga standardutföranden, och hur man analyserar de registrerade uppgifterna.
När du utformar ett experiment, måste forskare beakta att in vitro- modellen begränsas av MEA fast rutnätet som begränsar microgroove arrangemang. Användningen av en viss mikroflödessystem eller MEA design kommer att bero på de experimentella behov men generel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansierades av FEDER – Fundo Europeu de skattemyndigheten regionala fonder genom den tävla 2020 – Operacional programmet för konkurrenskraft och internationalisering (POCI), Portugal 2020, och av portugisiska medel genom FCT – Fundação para en Ciência e en Tecnologia / Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior inom ramen för projektet PTDC/CTM-NAN/3146/2014 (POCI-01-0145-FEDER-016623). José C Mateus stöddes av FCT (PD/BD/135491/2018). Paulo Aguiar stöddes av Programa Ciência – Programa Operacional Potencial Humano (POPH) – främjande av vetenskaplig sysselsättning, ESF och MCTES och program Investigador FCT, POPH och Fundo Social Europeu. Mikroflödessystem enheterna var fabricerade på INESC – Microsystems och nanoteknik, Portugal, under överinseende av João Pedro Conde och Virginia Chu.
Materials
| B-27 Suplement (50X) | Thermo Fisher Scientific | LTI17504-044 | |
| Branched poly(ethylene imine) (PEI), 25 kDa | Sigma-Aldrich | 408727 | Purify branched PEI by dialysis using a 2.5 kDa cut-off membrane for 3 days at 4°C against a 5 mM HCl solution (renewed daily). Freeze-dry the purified PEI. |
| Cell strainer (40 µm) | Falcon | 352340 | |
| Conical microtubes (1.5 ml) | VWR | 211-0015 | |
| Disposable diaper, 60×40 cm | Bastos Viegas SA | 455-019 | |
| Forceps Dumont #5, straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Forceps Dumont #5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Forceps Dumont #7, curved | Fine Science Tools | 91197-00 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Premium | Biowest | S181BH-500ML | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | Prepare laminin stock solution at 1 mg/mL by dissolving the powder in the respective volume of non-supplemented medium. Store laminin solution at -20 °C in small aliquots (20 µL) to avoid repeated freeze/thaw cycles. |
| L-Glutamine 200mM | Thermo Fisher Scientific | LTID25030-024 | |
| Neubauer improved counting chamber (hemocytometer) | Marienfeld | 630010 | |
| Neurobasal Medium (1X) | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | Basal medium used for neuronal cultures |
| PDMS microfluidic devices | not applicable | not applicable | Composed of two cell seeding compartments interconnected by 20 microgrooves with 450 μm length × 10 μm height × 14 μm width dimensions and separated by 86 µm (total interspace of 100 μm). |
| Penicillin-streptomycin (P/S) solution (100X) | Biowest | L0022-100 | |
| PES syringe filter unit (Ø 30 mm), 0.22 µm | Frilabo | 1730012 | |
| Polypropylene conical tubes, 15 ml | Thermo Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| Polypropylene conical tubes, 50 ml | Thermo Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 10 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 5 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Standard Regenerated cellulose membrane (2 kDa) | Spectrum labs | 132107 | |
| Standard surgical scissor | Fine Science Tools | 91401-14 | |
| Substrate-integrated planar MEAs (256 microelectrodes) | Multi Channel Systems | 256MEA100/30iR-ITO | 252 titanium nitride (TiN) recording electrodes and 4 internal reference electrodes organized in a 16 by 16 square grid. Each recording electrode is 30 µm in diameter and interspaced by 100 µm. |
| Syringe luer-lock tip, 10 ml | Terumo Europe | 5100-X00V0 | |
| Syringe luer-lock tip, 50 ml | Terumo Europe | 8300006682 | |
| Terg-A-Zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | Enzyme-active powdered detergent used for MEAs cleaning |
| Tissue culture plates, 35 mm | StemCell Technologies | 27150 | |
| Tissue culture plates, 90 mm | Frilabo | 900095 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Trypsin (1:250) | Thermo Fisher Scientific | 27250018 | |
| Vinyl tape 471 | 3M | B40071909 |
References
- Scanziani, M., Hausser, M. Electrophysiology in the age of light. Nature. 461 (7266), 930-939 (2009).
- Nam, Y., Wheeler, B. C. In vitro microelectrode array technology and neural recordings. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39 (1), 45-61 (2011).
- Obien, M. E., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 8, 423 (2014).
- Blau, A. Cell adhesion promotion strategies for signal transduction enhancement in microelectrode array in vitro electrophysiology: An introductory overview and critical discussion. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 18 (5), 481-492 (2013).
- Jones, I. L., et al. The potential of microelectrode arrays and microelectronics for biomedical research and diagnostics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (7), 2313-2329 (2011).
- Bakkum, D. J., et al. Tracking axonal action potential propagation on a high-density microelectrode array across hundreds of sites. Nature Communications. 4, 2181 (2013).
- Claverol-Tinture, E., Cabestany, J., Rosell, X. Multisite recording of extracellular potentials produced by microchannel-confined neurons in vitro. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 54 (2), 331-335 (2007).
- Fitzgerald, J. J., Lacour, S. P., McMahon, S. B., Fawcett, J. W. Microchannels as axonal amplifiers. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 55 (3), 1136-1146 (2008).
- Dworak, B. J., Wheeler, B. C. Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture. Lab on a Chip. 9 (3), 404-410 (2009).
- Morin, F., et al. Constraining the connectivity of neuronal networks cultured on microelectrode arrays with microfluidic techniques: a step towards neuron-based functional chips. Biosensors and Bioelectronics. 21 (7), 1093-1100 (2006).
- Pan, L., et al. Large extracellular spikes recordable from axons in microtunnels. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 22 (3), 453-459 (2014).
- Lewandowska, M. K., Bakkum, D. J., Rompani, S. B., Hierlemann, A. Recording large extracellular spikes in microchannels along many axonal sites from individual neurons. PLoS One. 10 (3), e0118514 (2015).
- Narula, U., et al. Narrow microtunnel technology for the isolation and precise identification of axonal communication among distinct hippocampal subregion networks. PLoS One. 12 (5), e0176868 (2017).
- Forro, C., et al. Modular microstructure design to build neuronal networks of defined functional connectivity. Biosensors and Bioelectronics. 122, 75-87 (2018).
- Frega, M., et al. Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays. Journal of Visualized Experiments. (119), (2017).
- Tukker, A. M., Wijnolts, F. M. J., de Groot, A., Westerink, R. H. S. Human iPSC-derived neuronal models for in vitro neurotoxicity assessment. Neurotoxicology. 67, 215-225 (2018).
- Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on micro-electrode arrays (MEAs). Journal of Visualized Experiments. (39), (2010).
- van Pelt, J., Wolters, P. S., Corner, M. A., Rutten, W. L., Ramakers, G. J. Long-term characterization of firing dynamics of spontaneous bursts in cultured neural networks. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 51 (11), 2051-2062 (2004).
- Wagenaar, D. A., Pine, J., Potter, S. M. An extremely rich repertoire of bursting patterns during the development of cortical cultures. BMC Neuroscience. 7, 11 (2006).
- Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxygen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
- Heiney, K., et al. . μSpikeHunter: An advanced computational tool for the analysis of neuronal communication and action potential propagation in microfluidic platforms. , (2018).
