Microfluídica interfaceamento com matrizes de microeletrodos para estudar comunicação Neuronal e propagação de sinal Axonal
Summary
Este protocolo visa demonstrar como combinar em vitro matrizes de microeletrodos com dispositivos microfluídicos para estudar a transmissão do potencial de ação em culturas neuronal. Análise de dados, ou seja, a detecção e caracterização de potenciais de ação, de propagação é realizada utilizando um novo avançado, ainda amigável e livremente disponível, ferramenta computacional.
Abstract
Matrizes de microeletrodos (MEAs) são amplamente utilizados para estudar a função neuronal em vitro. Estes dispositivos permitem simultânea gravação/estimulação não-invasiva da atividade eletrofisiológica por longos períodos. No entanto, a propriedade de sensoriamento de sinais de todas as fontes em torno de cada microeletrodos pode tornar-se desfavorável ao tentar compreender a comunicação e propagação em circuitos neuronais do sinal. Em uma rede neuronal, vários neurônios podem ser ativados simultaneamente e podem gerar potenciais de ação sobrepostas, dificultando a discriminar e controlar a propagação do sinal. Considerando esta limitação, nós estabelecemos uma configuração em vitro focada na avaliação eletrofisiológica comunicação, que é capaz de isolar e amplificar sinais axonal com alta resolução espacial e temporal. Por interfaceando dispositivos microfluídicos e MEAs, somos capazes de compartimentalizar culturas neuronal com um alinhamento bem controlado dos axônios e microeletrodos. Esta configuração permite gravações de propagação de pico com uma alta relação sinal-ruído ao longo de várias semanas. Combinado com algoritmos de análise de dados especializados, fornece quantificação detalhada de vários comunicação relacionados propriedades tais como a velocidade de propagação de falha de condução, taxa de queima, picos anterógrada e mecanismos de codificação.
Este protocolo demonstra como criar uma configuração de cultura neuronal compartimentada sobre MEAs integrada ao substrato, como cultura neurônios nesta configuração e como com êxito, gravar, analisar e interpretar os resultados de tais experiências. Aqui, nós mostramos como a configuração estabelecida simplifica a compreensão da comunicação neuronal e propagação de sinal axonal. Essas plataformas pavimentar o caminho para novos modelos em vitro com topografias de rede neuronal engenharia e controlável. Eles podem ser usados no contexto das culturas neuronais homogêneas, ou com configurações de cultura co onde, por exemplo, a comunicação entre os neurônios sensoriais e outros tipos de células é monitorizada e avaliada. Esta configuração fornece condições muito interessantes para estudar, por exemplo, neurodesenvolvimento, circuitos neuronais, informações de codificação, abordagens neurodegeneração e Epilepsias.
Introduction
Compreender a comunicação elétrica em circuitos neuronais é um passo fundamental para revelar a função normal e elaborar estratégias terapêuticas para tratar a disfunção. Os neurônios integram, computar e potenciais de ação (APs), que se propagam ao longo de seus axônios finos de relé. Técnicas eletrofisiológicas tradicionais (por exemplo, braçadeira do remendo) são técnicas poderosas para estudar a atividade neuronal, mas muitas vezes são limitadas para as maiores estruturas celulares, tais como o soma ou os dendritos. Técnicas de imagem para oferecer uma alternativa para estudar sinais axonal com alta resolução espacial, mas eles são tecnicamente difíceis de executar e não permita que a longo prazo as medidas1. Neste contexto, a combinação de matrizes de microeletrodos (ama) e microfluídica pode dar um contributo poderoso em divulgar as propriedades fundamentais de transmissão de atividade e do sinal de neuron´s dentro de redes neuronais em vitro2 , 3.
Tecnologia MEA baseia-se em gravações extracelulares de culturas neuronal. As principais vantagens desta metodologia eletrofisiológicos são sua capacidade de oferecer suporte a estimulação simultânea, a longo prazo e gravação em vários locais e em uma maneira não-invasiva de3. MEAs são feitos de biocompatíveis, altos microeletrodos condutivos e resistentes à corrosão incorporados em uma carcaça de vidro da bolacha. Eles são compatíveis com celulares convencionais cultura bio-revestimentos de, promovendo a adesão célula significativamente aumentam a resistência da selagem entre o substrato e as células3,4. Além disso, eles são versáteis no design e podem variar em tamanho de microeletrodos, geometria e densidade. MEAs trabalham global, como vasos de cultura de células convencional com a vantagem de permitir simultâneas de imagem ao vivo e eletrofisiológica gravações/estimulação.
O uso da tecnologia MEA tem contribuído para o estudo das características importantes de redes neurais,5. No entanto, existem características inerentes que limitam o desempenho de MEAs para estudar comunicação e propagação de APs em um circuito neuronal. MEAs permitem gravações de simples células e estruturas subcelulares mesmo como axônios, mas quando comparado aos sinais somal, sinais axonal têm uma muito baixa relação sinal-ruído (SNR)6. Além disso, a característica de sensoriamento potenciais de campo extracelular de todas as fontes em torno de cada microeletrodos dificulta o rastreamento da propagação de sinal em um circuito neuronal.
Estudos recentes têm demonstrado, no entanto, que melhores condições de gravação podem ser conseguidas tendo os microeletrodos alinhados dentro de microcanais estreito no qual podem crescer axônios. Essa configuração fornece um aumento significativo do SNR tal que axonal sinais de propagação pode ser facilmente detectado7,8,9,10,11,12, 13. A estratégia de aliar microfluidic dispositivos com tecnologia MEA cria um isolado eletricamente microambiente adequado para amplificar sinais axonal11. Além disso, a presença de múltiplos microeletrodos sensoriamento ao longo de um disco é fundamental para detecção e caracterização de propagação do sinal axonal.
Tais plataformas em vitro com topografias altamente controlável rede neuronal podem ser adaptadas para muitas perguntas de pesquisa14. Essas plataformas são apropriadas para ser utilizados no contexto das culturas neuronais, mas podem ser expandidas para engenheiro configurações de cultura co, onde a comunicação entre os neurônios e outros tipos de células pode ser monitorizada e avaliada. Assim, esta configuração fornece condições muito interessantes para explorar uma série de estudos neurais relacionados como neurodesenvolvimento, circuitos neuronais, informações de codificação, neurodegeneração e Epilepsias. Além disso, sua combinação com modelos emergentes de de15,de células-tronco pluripotentes induzidas humana16 pode abrir novos caminhos no desenvolvimento de terapias potenciais para doenças humanas que afetam o sistema nervoso.
Nosso laboratório está usando esta plataforma combinando microeletrodos com microfluídica (µEF) para compreender processos neuronais ao nível celular e rede e sua implicação na physio – e patológico sistema nervoso. Dado o valor de tal plataforma no campo da neurociência, o propósito do presente protocolo é demonstrar como criar uma cultura neuronal compartimentada sobre MEAs integrada ao substrato, como os neurônios de cultura nesta plataforma e como gravar com êxito, analisar e interpretar os resultados de tais experiências. Este protocolo certamente irá enriquecer a caixa de ferramentas experimental para culturas neuronal no estudo da comunicação neural.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo apresentado aqui mostra como montar um µEF, composto de um dispositivo microfluidic e um MEA com projetos padrão comercialmente disponíveis e como analisar os dados gravados.
Ao projetar um experimento, pesquisadores devem levar em conta que o modelo in vitro é limitado pela grade fixa de MEA, que restringe os arranjos do disco. O uso de um determinado microfluidic ou MEA design dependerá das necessidades específicas de experimentais, mas, em geral, as mesmas etapas …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo FEDER – Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional fundos até 2020 o COMPETE – Programa Operacional para a competitividade e internacionalização (POCI), Portugal 2020 e pelos portugueses de fundos através da FCT – Fundação para uma Ciência e uma Tecnologia / Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior no âmbito do projecto PTDC/CTM-NAN/3146/2014 (POCI-01-0145-FEDER-016623). José C Mateus foi apoiado pela FCT (PD/BD/135491/2018). Paulo Aguiar foi apoiada pelo Programa Ciência – Programa Operacional Potencial Humano (POPH) – promoção do emprego científico, FSE e MCTES e programa Investigador FCT, POPH e Fundo Social Europeu. Os dispositivos microfluídicos foram fabricados no INESC – microsistemas e nanotecnologias, Portugal, sob a supervisão de João Pedro Conde e Virginia Chu.
Materials
| B-27 Suplement (50X) | Thermo Fisher Scientific | LTI17504-044 | |
| Branched poly(ethylene imine) (PEI), 25 kDa | Sigma-Aldrich | 408727 | Purify branched PEI by dialysis using a 2.5 kDa cut-off membrane for 3 days at 4°C against a 5 mM HCl solution (renewed daily). Freeze-dry the purified PEI. |
| Cell strainer (40 µm) | Falcon | 352340 | |
| Conical microtubes (1.5 ml) | VWR | 211-0015 | |
| Disposable diaper, 60×40 cm | Bastos Viegas SA | 455-019 | |
| Forceps Dumont #5, straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Forceps Dumont #5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Forceps Dumont #7, curved | Fine Science Tools | 91197-00 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Premium | Biowest | S181BH-500ML | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | Prepare laminin stock solution at 1 mg/mL by dissolving the powder in the respective volume of non-supplemented medium. Store laminin solution at -20 °C in small aliquots (20 µL) to avoid repeated freeze/thaw cycles. |
| L-Glutamine 200mM | Thermo Fisher Scientific | LTID25030-024 | |
| Neubauer improved counting chamber (hemocytometer) | Marienfeld | 630010 | |
| Neurobasal Medium (1X) | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | Basal medium used for neuronal cultures |
| PDMS microfluidic devices | not applicable | not applicable | Composed of two cell seeding compartments interconnected by 20 microgrooves with 450 μm length × 10 μm height × 14 μm width dimensions and separated by 86 µm (total interspace of 100 μm). |
| Penicillin-streptomycin (P/S) solution (100X) | Biowest | L0022-100 | |
| PES syringe filter unit (Ø 30 mm), 0.22 µm | Frilabo | 1730012 | |
| Polypropylene conical tubes, 15 ml | Thermo Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| Polypropylene conical tubes, 50 ml | Thermo Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 10 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 5 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Standard Regenerated cellulose membrane (2 kDa) | Spectrum labs | 132107 | |
| Standard surgical scissor | Fine Science Tools | 91401-14 | |
| Substrate-integrated planar MEAs (256 microelectrodes) | Multi Channel Systems | 256MEA100/30iR-ITO | 252 titanium nitride (TiN) recording electrodes and 4 internal reference electrodes organized in a 16 by 16 square grid. Each recording electrode is 30 µm in diameter and interspaced by 100 µm. |
| Syringe luer-lock tip, 10 ml | Terumo Europe | 5100-X00V0 | |
| Syringe luer-lock tip, 50 ml | Terumo Europe | 8300006682 | |
| Terg-A-Zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | Enzyme-active powdered detergent used for MEAs cleaning |
| Tissue culture plates, 35 mm | StemCell Technologies | 27150 | |
| Tissue culture plates, 90 mm | Frilabo | 900095 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Trypsin (1:250) | Thermo Fisher Scientific | 27250018 | |
| Vinyl tape 471 | 3M | B40071909 |
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