Presenteras här är ett protokoll som kombinerar en in vitro -neural-endotelial Co-Culture system och metabolisk inkorporering av sialoglycan med bioorthogonal funktionella grupper för att expandera primära neurala stamceller och stamceller och märka deras yta sialoglykoproteiner för avbildning eller masspektrometri analys av cell ytan markörer.
Neurala stamceller och progenitorceller (NSPCs) är den cellulära grunden för komplexa strukturer och funktioner i hjärnan. De är belägna i specialiserade nischer in vivo och kan isoleras och utvidgas in vitro, som fungerar som en viktig resurs för celltransplantation för att reparera hjärnskador. Emellertid, NSPCs är heterogena och inte klart definierade på molekylär nivå eller renas på grund av brist på specifika cell ytan markörer. Det protokoll som presenteras, som tidigare har rapporterats, kombinerar en neural-endotelial Co-Culture system med en metabolisk glykananalys märkningsmetod för att identifiera ytan sialoglykoproteome av primära nspcs. NSPC-endotelial Co-Culture-systemet möjliggör självförnyelse och expansion av primära NSPCs in vitro, vilket genererar ett tillräckligt antal nspcs. Sialoglycans i odlade nspcs är märkta med en onaturlig sialic Acid metabolisk reporter med bioortogonala funktionella grupper. Genom att jämföra sialoglykoproteome från självförnyande NSPCs expanderat i en endotelial Co-kultur med differentierande neural kultur, identifierar vi en lista över membranproteiner som är berikade i NSPCs. Protokollet omfattar i detalj: 1) uppsättning av en NSPC-endotelial samkultur och NSPC-differentierande kultur. 2) märkning med azidosugar per-O-acetylerade N-azidoacetylmannosamin (AC4mannaz); och 3) biotin konjugation till modifierad sialoglycan för avbildning efter fixering av neurala kulturen eller protein utvinning från neurala kulturen för masspektrometri analys. Sedan, den NSPC-berikad yta markör kandidater väljs genom jämförande analys av masspektrometri data från både den expanderade NSPC och differentierade neurala kulturer. Detta protokoll är mycket känsligt för att identifiera membranproteiner med låg förekomst i utgångsmaterialen, och det kan appliceras på markör identifiering i andra system med lämpliga modifieringar
Neurala stamceller definieras som en multipotenta cellpopulation som kan förnyas för att bibehålla en stamcellspool och differentieras till nervceller och glia. De är de stora celltyperna i nervsystemet och kan erbjuda stor terapeutisk potential i regenerativ medicin genom celltransplantation till sjuka och skadade hjärnor1,2. Som utveckling fortsätter, den neurala stamceller befolkningen blir heterogena3,4, och andelen av neurala stamceller i hjärnan minskar gradvis5. Generellt sett, embryonala neurala stamceller och andra neurala stamceller, kallas kollektivt neurala stamceller och stamceller (NSPCs), finns i de embryon zoner, ventrikulär zon, och subventrikulär zon i möss6. I den embryonala hjärnan, neurala stamceller generera nervceller direkt eller indirekt genom mellanliggande stamceller (IPCS), och i vissa arter genom den yttre subventrikulär zon progenitorer (oRGs)7,8. Den specifika molekylära signatur, morfologi, lokalisering i stamceller nisch, och differentiering potential alla bestämma vilken roll varje subtyp i hjärnans organogenes och kliniska tillämpningar9. De tillgängliga cell ytmarkörerna kan dock inte entydigt diskriminera och rena olika undertyper av NSPCs, vilket begränsar förståelsen och utnyttjandet av dessa undertyper.
Identifieringen av primära NSPCs-ytmarkörer begränsas av tre stora hinder. Den första är den begränsade cellantal NSPCs i vävnaden, vilket gör det svårt att förbereda cell ytan protein prover för vanliga masspektrometri analys. Den andra begränsningen är svårigheten att producera rena cell undertyper för att generera subtypspecifika membranprotein data. Slutligen är den tredje utmaningen den låga kvoten av cellytproteiner i hela cellproteiner, vilket hämmar deras detektionskänslighet genom masspektrometrianalys.
För att övervinna dessa problem, utvecklade vi en chemoproteomic metod för att selektivt berika och identifiera cellyta proteiner i primära NSPCs genom metaboliskt märkning av sialoglykoproteiner10. För att generera ett tillräckligt antal nspcs, drog vi fördel av ett etablerat protokoll för att expandera och underhålla primära embryonala nspcs i odifferentierade tillstånd in vitro, genom Co-culturing nspcs med mus hjärnan endotelcelllinjer med hjälp av en genomsläpplig stöd Matrix INSERT (t. ex. transwell) system11. I motsats, npscs odlade ensam utan endotelceller generera differentierade avkomma11,12. Sålunda, protein prover från dessa två kultur system kan vara jämförelsevis analyseras för att identifiera proteiner som är differentially uttrycks i NSPCs och differentierade nervceller. Eftersom de flesta cell ytan proteiner modifieras av sialic Acid13, onaturliga sialic Acid föregångare analog N-azidoacetylmannosamine-tetraacylated (AC4mannaz) användes för att kapa den inneboende metaboliska vägen så att endogena, nyligen syntetiserade sialoglycans är märkta med azid grupper, generera ett kemiskt handtag14. Genom azido-alkyne-medierade biologiska ortogonala reaktioner, som konjugera biotin till sialoglycans, kan cellytproteiner visualiseras och berikas för proteomisk identifiering genom en streptavidin-kopplad fluorophore eller Matrix14.
Här utför vi färgning av SDS-PAGE gel analys av ytan sialoglykoproteome från NSPCs expanderat i en endotelial samodling och differentiera celler i en icke-Co-kultur system. Vi rengör också selektivt ytan sialoglykoproteome i de två kultur system för proteomisk jämförelse. Vårt protokoll, jämfört med den traditionella centrifugering-baserade cell ytan renings protokoll15, ökar utvinning effektivitet genom att minska ytan protein utvinning förfaranden genom specifika tagg konjugering och samhörighet Rening. Samtidigt ökar det utvinning renhet cell ytan proteiner bygger på förutsättningen att sialylation sker mestadels på cellytan proteiner. Även om endoteliala faktorer inte helt kan blockera differentiering av expanderade NSPCs, är den jämförande studien mellan en samkultur och differentierad kultur en praktisk metod för att lokalisera stamceller-berikade ytproteiner utan att behöva analysera proteiner från NPCs renade av FACS16. Vi anser att detta tillvägagångssätt kan tillämpas på studier av ytproteiner i andra system med lämpliga modifieringar.
Ytmarkörer används ofta för att märka och rena specifika celltyper in vitro och in vivo17,18. Upptäckten av ytmarkörer bidrar i hög grad till regenerativ medicin och stamcells forskning genom att tillhandahålla molekylära verktyg för att selektivt berika en stamcells population från normala eller patologiska vävnader och kultur rätter, som erbjuder en renad cell resurs för klinisk användning eller studiet av biologiska egenskaper. Framstegen med at…
The authors have nothing to disclose.
Figur 1b, 1c, 1e och 1f återges från Bai et al . 10 med tillstånd från Kungliga kemi förbundet. Vi tackar Yi Hao i X. C. ‘ s Lab för figur redigering. Detta arbete stöds av National Natural Science Foundation i Kina (nr 91753206 till Q. S. och X. C., nr 31371093 till Q. S., och nr 21425204 och 21672013 till X. C.).
BEND3 | ATCC | CRL-229 | |
DMEM | Gibco | 11960044 | |
L-glutamine | Gibco | 25030081 | 1% |
Sodium pyruvate | Sigma | P5280 | 1% |
N2 supplement | Gibco | 17502048 | 1 to 100 |
N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A7250 | 1 mM |
Papain | Worthington | LS003726 | 10 U/mL |
B27 supplement | Gibco | 17504044 | 1 to 50 |
Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |
basic Fibroblast growth factor | Gibco | PHG0261 | 10 ng/mL |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 1% |
Fetal bovine serum | Gibco | 10099141 | 10% |
HBSS | Gibco | 14175095 | |
Tripsin-EDTA, 0.25% | Gibco | 25200056 | |
DPBS | Gibco | 14190094 | |
Transwell | Corning | 3450 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4% |
Sucrose | Sangon | A100335 | |
DAPI | Gibco | 62248 | |
RIPA buffer | Thermo Scientific | 89900 | |
SDS-PAGE loading buffer 2X | Solarbio | P1018 | |
6-well plate | Corning | 3335 | |
Tris-Glycine protein gel | invitrogen | xp00100box | |
mouse monoclonal anti-Nestin | Developmental Study Hybridoma Bank | Rat-401 | 1 to 20 |
mouse monoclonal anti-beta-tubulin III | Sigma | T8860 | 1 to 1000 |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 | invitrogen | A-21121 | 1 to 1000 |
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG2b | invitrogen | A-21143 | 1 to 1000 |
Albumin Bovine V | Amresco | 0332 | |
Triton X-100 | Amresco | 0694 | |
BCA assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
Brij97 | Aladdin | B129088 | |
CuSO4 | Sigma | 209198 | |
alkyne-biotin | Click Chemistry Tools | TA105 | |
BTTAA | Click Chemistry Tools | 1236 | |
Ac4ManNAz | Click Chemistry Tools | 1084 | 100 µM |
9AzSia | synthesized in lab | ||
sodium ascorbate | Sigma | A4034 | |
Methanol | Sigma | 34860 | |
EDTA | Sangon | A100322 | |
NaCl | Sangon | A100241 | |
SDS | Sangon | A100227 | |
Alexa Flour 647-conjugated streptavidin | invitrogen | S21374 | 1 to 1000 |
Triethanolamine | Sigma | V900257 | |
Dynabeads M-280 Streptavidin | invitrogen | 60210 | |
ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
Coomassie Brilliant Blue R-250 | Thermo Scientific | 20278 | |
Isoflurane | RWD Life Science Co. | 970-00026-00 | |
DNase I | Sigma | DN25 | 12 µg/mL |
urea | Sigma | U5378 |