Ein Jodid-gelb fluoreszierende Protein-Gap Junction-interzelluläre Kommunikation Assay
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für eine neuartige Lücke Kreuzung interzelluläre Kommunikation Assay für den Hochdurchsatz-Screening von Lücke Kreuzung modulierende Chemikalien für die Arzneimittelforschung und toxikologische Bewertung entwickelt.
Abstract
GAP Junctions (GJs) sind Zellmembran-Kanäle, die Diffusion von Molekülen zwischen benachbarten Zellen kleiner als 1 kDa ermöglichen. Da sie physiologische und pathologische Rollen haben, braucht der Hochdurchsatz-screening (HTS) Assays, GJ-Modulatoren in Drug Discovery und Toxikologie Tests zu identifizieren. Ein neuartige Jodid-gelb fluoreszierende Protein-Gap Junction interzelluläre Kommunikation (I-YFP-GJIC) Assay erfüllt dieses Bedürfnis. Es ist eine zellbasierte Assays einschließlich Akzeptor und Spender-Zellen, die entwickelt sind, um stabil gelb fluoreszierenden Proteins (YFP) Variante, zum Ausdruck bringen deren Fluoreszenz sensibel von Jodid oder SLC26A4, ein Transporter Jodid bzw. gestillt ist. Wenn eine Mischkultur aus zwei Zelltypen Jodid hinzugefügt wird, sie betreten die Spenderzellen über den SLC26A4-Transporter und diffundieren zu den angrenzenden Akzeptor-Zellen über GJs wo sie die YFP Fluoreszenz zu stillen. YFP Fluoreszenz wird nun durch die nun in einem kinetischen Modus gemessen. Die YFP abschrecken Rate spiegelt GJ Aktivität. Der Test ist zuverlässig und schnell genug für HTS verwendet werden Das Protokoll für die e-YFP-GJIC-Assay mit LN215 Gliom menschliche Zellen, wird beschrieben.
Introduction
GAP Junctions (GJs) fungieren als interzelluläre Kanäle ermöglichen die Diffusion kleiner Moleküle von < 1 kDa wie Nährstoffe, Stoffwechselprodukte und Signalmoleküle zwischen benachbarten Zellen. Die Knoten Elemente sind mit einem Hemichannel oder Connexon in jede Zelle und jedes Connexon stellt sechs Connexine (Cxs)1. GJs und Cxs wurden in Toxikologie Tests von Karzinogenen wie polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK), verwendet die GJ-Hemmer2,3,4sind. Gestörten GJIC wurde Nongenotoxic Karzinogenese5,6zugeordnet. Als eine mögliche therapeutische Ziel wurde GJ Beteiligung in bestimmte Subtypen der Anfälle7,8, Schutz von Herz und Gehirn Ischämie/Reperfusion Verletzungen9, Migräne mit Aura10berichtet, Arzneimittel-induzierte Leberschäden6,11und12der Wundheilung. Hochdurchsatz-screening (HTS) Tests sind erforderlich, GJ moduliert Chemikalien oder Antikörper für die Arzneimittelforschung für Toxikologie Assays zu identifizieren und zu neuartigen zelluläre Regulatoren des GJ Aktivität zu identifizieren. HTS-Assays können auch zur Untersuchung von Struktur-Aktivitäts-Beziehungen von GJ Modulatoren2,13,14,15.
Einige GJIC-Assays sind Dye Transfer oder dual Patch-Clamp-Techniken. Luzifer gelb CH (LY) und Calcein Acetoxymethyl Ester (Calcein-AM) wurden in Farbübertragungs-Tests verwendet. Zellen sind nicht durchlässig für LY, die durch Mikroinjektion, Schaben laden oder Elektroporation eingebracht wird. Einmal im Inneren der Zelle LY breitet sich in benachbarten Zellen über GJs und GJ Aktivität wird durch das Ausmaß der LY Migration16untersucht. Calcein-AM-Assays beinhalten in der Regel Lücke-Fluoreszenz Erholung nach Immunofluoreszenz17,18. Calcein-AM ist ein Zelle-permeationsfähigen Farbstoff, der durch eine intrinsische Esterase intrazellulär in undurchlässigen Calcein umgewandelt wird. Der Test erfordert ein confocal Mikroskop zu beobachten, die Übertragung von Calcein-AM in eine Zelle von diejenigen, die es nach Laser Immunofluoreszenz. Wenn funktionale GJs vorhanden sind, Calcein-AM in benachbarten Zellen tritt die Photobleached Zellen und die Fluoreszenz wird wiederhergestellt. GJ-Aktivität wird durch das Ausmaß der Fluoreszenz Erholung der Photobleached Zellen untersucht. Farbübertragungs-Assays sind mühsam und zeitaufwändig oder niedrige Empfindlichkeiten. Dual Patch spannen ist eine elektrophysiologische Methode, die Knoten Leitwert misst. Es ist relativ empfindlich, durch eine direkte Abhängigkeit der Leitfähigkeit die Anzahl der offenen GJs19; jedoch ist es technisch anspruchsvoll, zeitaufwendig und teuer20. Die e-YFP-GJIC-Assay wurde entwickelt für den Einsatz in HTS
Abbildung 1 zeigt die Komponenten und die Schritte des-YFP GJIC Assays, die Akzeptor-Zellen mit dem Ausdruck einer Iodid-Sensitive YFP Variante mit H148Q und I152L nutzt (YFPQL) und Spenderzellen mit dem Ausdruck einer Iodid-Transporter (SLC26A4)21 . Die beiden Mutationen durchführte, YFPQL ermöglichen abschrecken der Fluoreszenz von Iodid22. Jodide sind Co kultivierten Akzeptor und Spenderzellen hinzugefügt; Geben Sie nicht die Akzeptor-Zellen, sondern werden durch die vorliegenden SLC26A4-Transporter auf der Spenderzellen aufgegriffen. Jodide in die Spenderzellen diffundieren durch funktionierende GJs in angrenzenden Akzeptor Zellen, wo sie die YFPQL Fluoreszenz zu stillen. GJs sind geschlossen oder durch Inhibitoren blockiert, kann nicht Iodid der Akzeptor Körperzellen um die Fluoreszenz stillen gelangen. Die YFPQL abschrecken Rate spiegelt GJ Aktivität. Die Testverfahren YFP GJIC ist weder kompliziert noch zeitaufwändig. Es ist kompatibel mit HTS und kann verwendet werden, um die Auswirkungen einer großen Anzahl von Verbindungen auf GJ Aktivität in einem relativ kurzen Zeitraum zu testen. Es erfordert nur Akzeptor und Spenderzellen und zwei ausgewogene Salzlösungen. Das unten beschriebene Protokoll basiert auf LN215 Zellen, deren großen Cx Cx4321ist. LN215 und LN215-YFPQL Rezeptor-ich− Spenderzellen entstanden durch Transduktion mit Lentiviren YFPQL oder SLC26A421,23zum Ausdruck zu bringen.
Protocol
Representative Results
Discussion
E-YFP-GJIC-Assay kann für HTS verwendet werden, denn es robust, schnell und preiswert ist. Ein HTS Assay gilt als robust wenn die Z’-Faktor ist über 0,525. Siehe Zhang Et Al. für eine Beschreibung der statistischen Analyse zur Beurteilung der Eignung von HTS-Assays25. Wenn LN215 Zellen verwendet wurden, die Z’-Faktor war > 0,5 ohne jede Assay-Optimierung. Wenn andere Zelltypen in der Test und seine Z verwendet werden “-Faktor ist < 0,5, die Robustheit durch die Verlänge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde unterstützt durch das grundlegende Wissenschaft Forschungsprogramm durch die National Research Foundation von Korea (NRF) finanziert durch das Ministerium für Bildung (2011-0023701, 2016R1D1A1A02937397 und 2018R1A6A1A03023718).
Materials
| 96-well plate | SPL | 30096 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C5670 | I-solution |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | C-solution, I-solution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | sigma | 276855 | |
| HEPES | Sigma | RES6003H-B7 | C-solution, I-solution |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | transfection reagent |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2 6H2O) | Sigma | M2393 | C-solution |
| Microplate reader | BMG LabTech | POLARstar Omega 415-1618 | |
| pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| Polybrene | sigma | H9268 | |
| Poly-L-lysine solution | sigma | P4707 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | C-solution, I-solution |
| psPAX2 | Addgene | #12260 | |
| Puromycin Dihydrochloride | sigma | P8833 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S5886 | C-solution, I-solution |
| Sodium hyroxide (NaOH) | Sigma | S2770 | |
| Sodium Iodide (NaI) | Sigma | 383112 | I-solution |
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