Um ensaio de comunicação intercelular junção iodeto-amarelo fluorescente proteína-Gap
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para um ensaio de comunicação intercelular junção romance lacuna projetado para o rastreio da elevado-produção de químicos de junção-modulando de lacuna para descoberta de drogas e avaliação toxicológica.
Abstract
Junções (GJs) são canais de membrana celular que permitem a difusão de moléculas menores que 1 kDa entre células adjacentes. Como eles têm papéis fisiológicos e patológicos, há necessidade de elevado-throughput screening (HTS) ensaios para identificar moduladores GJ em ensaios de toxicologia e descoberta de drogas. Um ensaio de comunicação intercelular-junção (I-YFP-GJIC) romance iodeto-amarelo fluorescente proteína-lacuna preenche essa necessidade. É um ensaio baseados em células, incluindo células aceitador e doadores que são projetadas para expressar estàvel uma variante da proteína fluorescente amarela (YFP), cuja fluorescência é saciada com sensibilidade por iodeto, ou SLC26A4, transportador de iodeto, respectivamente. Quando o iodeto é adicionado a uma cultura mista, os tipos de duas células, eles entram as células do doador através do transportador de SLC26A4 e difundem para as células adjacentes aceitador através de GJs onde eles saciar a fluorescência YFP. YFP fluorescência é medida bem por bem em um modo cinético. A taxa de resfriamento YFP reflete a atividade GJ. O ensaio é confiável e rápida o suficiente para ser usado para HTS O protocolo para o ensaio YFP GJIC usando as células LN215, células de glioma humano, é descrito.
Introduction
Junções (GJs) atuam como Canais intercelulares para permitir a difusão de pequenas moléculas de < 1 kDa como nutrientes, metabolitos e moléculas de sinalização entre células adjacentes. Os elementos juncionais incluem um hemichannel ou connexon em cada célula, e cada connexon constitui seis connexins (Cxs)1. GJs e Cxs têm sido utilizados em ensaios de toxicologia de carcinógenos como hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (PAH), que são inibidores GJ2,3,4. Interrompido GJIC tem sido associada com nongenotoxic carcinogênese5,6. Como um potencial alvo terapêutico, GJ envolvimento tem sido relatado em particulares subtipos de convulsões7,8, proteção de cardíacos e cérebro isquemia/reperfusão lesão9, enxaqueca com aura10, lesão hepática induzida por drogas6,11e12de cicatrização de feridas. Elevado-throughput screening (HTS) ensaios são necessários para identificar produtos químicos GJ-modulando ou anticorpos para descoberta de drogas, para ensaios de toxicologia e identificar o romance celulares reguladores da atividade GJ. Ensaios HTS também podem ser usados para investigar as relações estrutura-atividade de GJ moduladores2,13,14,15.
Alguns ensaios GJIC incluem a transferência de tintura ou técnicas de braçadeira do remendo dual. Amarelo de Lúcifer CH (LY) e calceína acetoximetil éster (calceína-AM) têm sido utilizados em ensaios de corante-transferência. As células não são permeáveis a LY, que é introduzido pela microinjeção, raspar a carregar ou eletroporação. Uma vez dentro da célula, LY se espalha em vizinhos células através do GJs e atividade GJ é analisada pela extensão do LY migração16. Ensaios de calceína-AM geralmente envolvem recuperação lacuna-fluorescência após fotobranqueamento17,18. Calceína-AM é um corante permeant-célula que é convertido intracelular calceína impermeável por uma esterase intrínseca. O ensaio requer um microscópio confocal para observar a transferência de calceína-AM em uma célula de aqueles ao seu redor seguindo fotobranqueamento do laser. Se GJs funcionais estão presentes, em células adjacentes da calceína-AM entra as células foto e a fluorescência é recuperada. Atividade GJ é analisada pela extensão da recuperação de fluorescência das células foto. Ensaios com tintura-transferência são trabalhosos e demorados ou têm baixa sensibilidade. Remendo de duplo fixação é um método eletrofisiológico que mede a condutância juncional. É relativamente sensível, com uma dependência direta de condutância no número de aberto GJs19; no entanto, é tecnicamente exigente, demorado e caro20. O ensaio YFP GJIC foi desenvolvido para uso em HTS
A Figura 1 ilustra os componentes e as etapas do ensaio eu YFP GJIC, que utiliza células de aceitador expressando uma variante de iodeto sensíveis YFP rolamento H148Q e I152L (YFPQL) e doador de células expressando um transportador de iodeto (SLC26A4)21 . As duas mutações transportadas por YFPQL permitem têmpera de fluorescência por iodeto22. Iodetos são adicionados ao aceitador co cultivada e as células do doador; Eles não entram as células aceitador, mas são ocupados pelos transportadores de SLC26A4 presentes sobre as células do doador. Iodetos nas células do doador se espalham através de funcionamento GJs células adjacentes aceitador onde eles saciar a fluorescência YFPQL . Se GJs são fechadas ou bloqueadas por inibidores, iodeto não pode inserir as células aceitador para saciar a fluorescência. A taxa de resfriamento YFPQL reflete a atividade GJ. O procedimento de ensaio GJIC eu-YFP não é complicado nem demorado. É compatível com HTS e pode ser usado para testar os efeitos de um grande número de compostos na atividade GJ em um período relativamente curto. Requer apenas aceitador e células do doador e duas soluções de sal equilibradas. O protocolo descrito abaixo baseia-se em células LN215, cujo principal Cx é Cx4321. O receptor de LN215-YFPQL e o LN215-eu− células de doadores foram geradas por transdução com lentivírus expressando YFPQL ou SLC26A421,23.
Protocol
Representative Results
Discussion
O ensaio YFP GJIC pode ser usado para HTS, porque é robusto, rápido e barato. Um ensaio HTS é considerado robusto se o Z’-fator é acima de 0,525. Ver Zhang et al para obter uma descrição da análise estatística usada para avaliar a adequação de HTS ensaios25. Quando as células de LN215 foram usadas, o Z’-fator foi > 0,5 sem qualquer otimização de ensaio. Se outros tipos de células são usados no ensaio e seu Z’-fator é < 0.5, a robustez pode ser melhorada, ala…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada pelo programa de pesquisa de ciência básica através da nacional Research Foundation de Coreia (NRF) financiado pelo Ministério da educação (2011-0023701, 2016R1D1A1A02937397 e 2018R1A6A1A03023718).
Materials
| 96-well plate | SPL | 30096 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C5670 | I-solution |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | C-solution, I-solution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | sigma | 276855 | |
| HEPES | Sigma | RES6003H-B7 | C-solution, I-solution |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | transfection reagent |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2 6H2O) | Sigma | M2393 | C-solution |
| Microplate reader | BMG LabTech | POLARstar Omega 415-1618 | |
| pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| Polybrene | sigma | H9268 | |
| Poly-L-lysine solution | sigma | P4707 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | C-solution, I-solution |
| psPAX2 | Addgene | #12260 | |
| Puromycin Dihydrochloride | sigma | P8833 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S5886 | C-solution, I-solution |
| Sodium hyroxide (NaOH) | Sigma | S2770 | |
| Sodium Iodide (NaI) | Sigma | 383112 | I-solution |
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