Iodide-gul fluorescerende Protein-Gap Junction-intercellulære kommunikasjon analysen
Summary
Her presenterer vi en protokoll for en roman gapet krysset intercellulære kommunikasjon analysen utformet for høy gjennomstrømming screening av gapet krysset-modulerende kjemikalier for medisiner og toksikologisk vurdering.
Abstract
Gapet veikryss (GJs) er cellemembranen kanaler at spredningen av molekyler mindre enn 1 kDa mellom tilstøtende celler. Som de har fysiologiske og patologiske roller, er det behov for høy gjennomstrømming screening (HTS) analyser å identifisere GJ modulatorer i stoffet funnet og toksikologiske analyser. En roman iodide-gul fluorescerende protein-gap krysset-intercellulære kommunikasjon (I-YFP-GJIC) analysen oppfyller dette behovet. Det er en cellebasert analysen inkludert acceptor og donor cellene som er konstruert for å uttrykke stabilt en gul fluorescerende protein (YFP)-varianten, som fluorescens er følsomt slukket iodide eller SLC26A4, en iodide transporter, henholdsvis. Når iodide legges til en blandet kultur de to celletyper, de inn donor cellene via den SLC26A4 transporter og diffuse til tilstøtende acceptor cellene via GJs hvor de slukke YFP fluorescens. YFP fluorescens måles bra ved brønnen i kinetic modus. YFP slukke hastigheten gjenspeiler GJ aktivitet. Analysen er pålitelig og rask nok til å brukes for HTS. Protokollen for jeg-YFP-GJIC analysen bruker de LN215 cellene, menneskelige glioma celler, er beskrevet.
Introduction
Gapet veikryss (GJs) fungere som intercellulære kanaler slik at spredningen av små molekyler av < 1 kDa som næringsstoffer, metabolitter og signalnettverk molekylene mellom tilstøtende celler. Junctional elementene inkludere en hemichannel eller connexon i hver celle, og hver connexon utgjør seks connexins (Cxs)1. GJs og Cxs har blitt brukt i toksikologiske analyser av kreftfremkallende stoffer som Polysykliske aromatiske hydrokarboner (PAH), som GJ hemmere2,3,4. Forstyrret GJIC har vært forbundet med nongenotoxic kreft5,6. Som potensielle terapeutiske mål, har GJ engasjement blitt rapportert i bestemte undergrupper av beslag7,8, beskyttelse mot hjerte og hjernen iskemi/reperfusion skade9, migrene med aura10, stoff-indusert leverskade6,11og12for sårtilheling. Høy gjennomstrømming screening (HTS) analyser er nødvendig å identifisere GJ-modulerende kjemikalier eller antistoffer for narkotika funn, for toksikologiske analyser, og identifisere romanen mobilnettet regulatorer GJ aktivitet. HTS-analyser kan også brukes til å undersøke strukturen-aktivitet relasjoner GJ, modulatorer,2,,13,,14,,15.
Noen GJIC analyser inkluderer fargestoff overføring eller dobbelt oppdateringen klemme teknikker. Lucifer gule CH (LY) og calcein acetoxymethyl ester (calcein-AM) har blitt brukt i Thermo-transfer analyser. Celler er ikke permeable til LY, som er innført av microinjection, skrape lasting eller electroporation. En gang inne i cellen, LY sprenges inn i nærliggende celler via GJs og GJ aktivitet er assayed av omfanget av LY migrasjon16. Calcein-AM analyser innebære vanligvis gap-fluorescens gjenoppretting etter photobleaching17,18. Calcein-AM er en celle-permeant fargestoff som konverteres intracellulært til ugjennomtrengelige calcein med en innebygd esterase. Analysen krever AC confocal mikroskop å observere overføring av calcein-AM i en celle fra de rundt etter laser photobleaching. Hvis funksjonelle GJs, calcein-AM i tilstøtende celler går inn photobleached cellene og fluorescensen er gjenopprettet. GJ aktivitet er assayed av omfanget av fluorescens utvinning av photobleached celler. Thermo-transfer analyser er arbeidskrevende og tidkrevende eller har lav følsomhet. Dobbel oppdateringen clamping er en elektrofysiologiske metode som måler junctional konduktans. Det er relativt følsom, med en direkte avhengighet av konduktans på antall åpne GJs19; men krevende den teknisk, tidkrevende og kostbar20. Jeg-YFP-GJIC analysen ble utviklet for bruk i HTS.
Figur 1 illustrerer komponentene og trinnene av-YFP GJIC analysen, som utnytter acceptor celler uttrykke en iodide-sensitive YFP variant med H148Q og I152L (YFPQL) og giver celler uttrykke en iodide transporter (SLC26A4)21 . To mutasjoner båret av YFPQL tillate slukke av fluorescens av iodide22. Iodides legges til co kulturperler acceptor og giver celler; de angir ikke acceptor celler, men tas av SLC26A4 transportører tilstede på donor cellene. Iodides i donor cellene diffus gjennom fungerende GJs i tilstøtende acceptor celler der de slukke YFPQL fluorescens. Hvis GJs er lukket eller blokkert av hemmere, angi ikke iodide acceptor cellene for å slukke fluorescensen. YFPQL slukke hastigheten gjenspeiler GJ aktivitet. YFP GJIC analysen prosedyren er verken komplisert eller tidkrevende. Den er kompatibel med HTS kan brukes til å teste effekten av et stort antall forbindelser GJ aktivitet i en relativt kort periode. Det krever bare acceptor og donor cellene, og to balansert salt løsninger. Protokollen beskrevet nedenfor er basert på LN215 celler med store Cx er Cx4321. LN215-YFPQL reseptoren og LN215-jeg− giver celler ble generert av signaltransduksjon med lentiviruses uttrykke YFPQL eller SLC26A421,23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Jeg-YFP-GJIC analysen kan brukes for HTS fordi det er robust, rask og billig. HTS analysen anses robust hvis Z “-faktor er over 0,525. Se Zhang et al. en beskrivelse av statistisk analyse brukes til å vurdere hensiktsmessigheten av HTS søk25. Når LN215 celler ble brukt, Z “-faktor var > 0,5 uten noen analysen optimalisering. Hvis andre celletyper brukes i analysen og dens Z “-faktoren er < 0,5 robusthet kan forbedres ved å utvide analysen tid21. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble støttet av grunnleggende vitenskap forskningsprogrammet gjennom National Research Foundation av Korea (NRF) finansiert av departementet for utdanning (2011-0023701, 2016R1D1A1A02937397, og 2018R1A6A1A03023718).
Materials
| 96-well plate | SPL | 30096 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C5670 | I-solution |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | C-solution, I-solution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | sigma | 276855 | |
| HEPES | Sigma | RES6003H-B7 | C-solution, I-solution |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | transfection reagent |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2 6H2O) | Sigma | M2393 | C-solution |
| Microplate reader | BMG LabTech | POLARstar Omega 415-1618 | |
| pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| Polybrene | sigma | H9268 | |
| Poly-L-lysine solution | sigma | P4707 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | C-solution, I-solution |
| psPAX2 | Addgene | #12260 | |
| Puromycin Dihydrochloride | sigma | P8833 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S5886 | C-solution, I-solution |
| Sodium hyroxide (NaOH) | Sigma | S2770 | |
| Sodium Iodide (NaI) | Sigma | 383112 | I-solution |
References
- Goodenough, D. a., Goliger, J. a., Paul, D. L. Connexins, connexons, and Intercellular Communication. Annual Review of Biochemistry. 65, 475-502 (1996).
- Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. Modulated Gap Junctional Intercellular Communication as a Biomarker of PAH Epigenetic Toxicity: Structure-Function Relationship. Environmental Health Perspectives. 106, 975 (1998).
- U, J. E. T., Chang, C., Upham, B., Wilson, M. Epigenetic toxicology as toxicant-induced changes in intracellular signalling leading to altered gap junctional intercellular communication. Toxicology Letters. , 71-78 (1998).
- Yamasaki, H. Role of disrupted gap junctional intercellular communications in detection and characterization of carcinogens. Mutation Research – Reviews in Genetic Toxicology. , (1996).
- Yamasaki, H., et al. Gap junctional intercellular communication and cell proliferation during rat liver carcinogenesis. Environmental Health Perspectives. 101, 191-197 (1993).
- Vinken, M., et al. Gap junctional intercellular communication as a target for liver toxicity and carcinogenicity. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 44, 201-222 (2009).
- Fonseca, C. G., Green, C. R., Nicholson, L. F. B. Upregulation in astrocytic connexin 43 gap junction levels may exacerbate generalized seizures in mesial temporal lobe epilepsy. Brain Research. 929 (1), 105-116 (2002).
- Garbelli, R., et al. Expression of connexin 43 in the human epileptic and drug-resistant cerebral cortex. Neurology. 76 (10), 895-902 (2011).
- Schulz, R., et al. Connexin 43 is an emerging therapeutic target in ischemia/reperfusion injury, cardioprotection and neuroprotection. Pharmacology and Therapeutics. 153, 90-106 (2015).
- Sarrouilhe, D., Dejean, C., Mesnil, M. Involvement of gap junction channels in the pathophysiology of migraine with aura. Frontiers in Physiology. , (2014).
- Patel, S. J., et al. Gap junction inhibition prevents drug-induced liver toxicity and fulminant hepatic failure. Nature Biotechnology. 30 (2), 179-183 (2012).
- Kandyba, E. E., Hodgins, M. B., Martin, P. E. A murine living skin equivalent amenable to live-cell imaging: analysis of the roles of connexins in the epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 128 (4), 1039-1049 (2008).
- Upham, B. L., et al. Differential roles of 2 , 6 , and 8 carbon ceramides on the modulation of gap junctional communication and apoptosis during carcinogenesis. Cancer Letters. 191, 27-34 (2003).
- Upham, B. L., et al. Structure-activity-dependent regulation of cell communication by perfluorinated fatty acids using in vivo and in vitro model systems. Environmental Health Perspectives. 117 (4), 545-551 (2009).
- Weis, L. M., et al. Bay or Baylike Regions of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons Were Potent Inhibitors of Gap Intercellular Communication. Environmental Health Perspectives. 106 (1), 17-22 (1998).
- el-Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-Loading and Dye Transfer: A Rapid and Simple Technique to Study Gap Junctional Intercellular Communication. Experimental Cell Research. 168 (2), 422-430 (1987).
- Wade, M. H., Trosko, J. E., Schindler, M. Photobleaching Assay of Gap Junction- Mediated Communication Between Human Cells. Advancement of Science. 232 (4749), 525-528 (2010).
- Abbaci, M., et al. In vitro characterization of gap junctional intercellular communication by gap-FRAP technique. Proceedings of SPIE. , 585909 (2005).
- Neyton, J., Trautmann, A. Single-channel currents of an intercellular junction. Nature. 317 (6035), 331-335 (1985).
- Wilders, R., Jongsma, H. J. Limitations of the dual voltage clamp method in assaying conductance and kinetics of gap junction channels. Biophysical Journal. 63 (4), 942-953 (1992).
- Lee, J. Y., Choi, E. J., Lee, J. A new high-throughput screening-compatible gap junctional intercellular communication assay. BMC Biotechnology. 15 (1), 1-9 (2015).
- Galietta, L. J. V., Haggie, P. M., Verkman, A. S. Green fluorescent protein-based halide indicators with improved chloride and iodide affinities. FEBS Letters. 499 (3), 220-224 (2001).
- Lee, J. Y., Yoon, S. M., Choi, E. J., Lee, J. Terbinafine inhibits gap junctional intercellular communication. Toxicology and Applied Pharmacology. 307, 102-107 (2016).
- Hughes, J., Rees, S., Kalindjian, S., Philpott, K. Principles of early drug discovery. British Journal of Pharmacology. 162 (6), 1239-1249 (2011).
- Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Upham, B. L. Role of Integrative Signaling Through Gap Junctions in Toxicology. Current Protocols in Toxicology. , (2011).
- Schalper, K. A., et al. Modulation of gap junction channels and hemichannels by growth factors. Molecular BioSystems. 8 (3), 685-698 (2012).
- Kulkarni, G. V., Mcculloch, C. A. G. Serum deprivation induces apoptotic cell death in a subset of Balb / c 3T3 fibroblasts. Journal of Cell Science. 1179, 1169-1179 (1994).
- Harris, A. L., Locke, D. Permeability of Connexin Channels. Connexins. , 165-206 (2009).
- Choi, E. J., Yeo, J. H., Yoon, S. M., Lee, J. Gambogic Acid and Its Analogs Inhibit Gap. Junctional Intercellular Communication. 9, 1-10 (2018).
