تقييم سلامة الحمض النووي الخلايا الجذعية للعلاج بخلايا القلب
Summary
هنا، نحن نقدم وصفاً مفصلاً للإعداد التجريبية لإجراء تحليل لتقييم سلامة الحمض النووي في الخلايا الجذعية قبل زرع الخلايا.
Abstract
الجذعية والخلايا المشتقة من الخلايا الجذعية لديها إمكانات هائلة كعلاج التجديدي لمختلف الأمراض التنكسية. الحمض النووي هو مستودع البيانات الوراثية في كافة الخلايا، بما في ذلك الخلايا الجذعية، وسلامتها أمر أساسي لقدرتها على التجدد. الخلايا الجذعية البالغة الخضوع للنشر السريع في مختبرات لتحقيق الأرقام اللازمة للزرع. نمو الخلايا السريع يؤدي إلى فقدان سلامة الحمض النووي والايضات المتراكمة، مثل الأكسجين التفاعلية والكربونيل alkylating وكلاء. زرع هذه الخلايا سيسفر engraftment الفقيرة وتجديد الجهاز المتدهورة. وعلاوة على ذلك، زرع الخلايا التالفة الحمض النووي يؤدي إلى طفرات، عدم الاستقرار الحمض النووي، والشيخوخة الخلوية، وربما تهدد الحياة من الأمراض مثل السرطان. ولذلك، هناك حاجة ملحة لأسلوب مراقبة الجودة لتقييم مدى ملاءمتها للخلية لزرع الأعضاء. هنا، نحن نقدم البروتوكولات خطوة بخطوة لتقييم سلامة الحمض النووي للخلايا الجذعية قبل زرع الخلايا.
Introduction
وتبين الأدلة التجريبية والسريرية أن زرع الخلايا يمكن معتدلة لتحسين أداء البطين الأيسر الهوس من فشله في قلوب1،2،،من34،5 ،،من67،،من89. التطورات الأخيرة قد فتحت زيادة جاذبية الفرص لإنعاش القلب والأوعية الدموية؛ وتشمل هذه التعبير القسري من عوامل إعادة برمجة خلايا جسدية للحث على بلوريبوتينسي وتفرق هذه الخلايا الجذعية المستحثة pluripotent (التوجيهية) في الأنساب القلب مختلفة، ومن المهم كارديوميوسيتي (سم)10، 11 , 12 , 13-المواد الوراثية في كل خلية، بما في ذلك إيبسكس الذي تم إنشاؤه اصطناعياً والمستمدة من اللجنة التوجيهية سم (iPS-سم)، هو الحمض النووي. ويملي التعليمات الوراثية المخزنة في الحمض النووي النمو والتنمية، ووظيفة الخلايا والأنسجة، وأجهزة، والكائنات الحية. الحمض النووي ليست خاملة؛ خلية الأيض، مثل الأكسجين التفاعلية والكربونيل، والأنواع النيتروجين، و alkylating وكلاء يمكن أن الحمض النووي يسبب الضرر في المختبر والمجراه في14،15،،من1617. الأهم من ذلك، يحدث تلف الحمض النووي بداهة في كل خلية، بتواتر كبير. إذا لم يتم تصحيح هذه الأضرار، فإنه سيؤدي إلى طفرة الحمض النووي، والشيخوخة الخلوية، وفقدان سلامة الحمض النووي، والخلية، وربما، من الأمراض، بما في ذلك السرطان تهدد الحياة. لذلك، الإبقاء على سلامة الحمض النووي ضروري لأي خلية، وبخاصة إيبسكس، التي تتمتع بإمكانات هائلة في العيادة.
لتقييم كمية والسلامة لعزل الحمض النووي، تتوفر معدات باهظة الثمن في السوق. ومع ذلك، هناك أية أساليب بسيطة وفعالة من حيث التكلفة لتقييم سلامة الحمض النووي في الخلايا دون عزل الخلايا. وعلاوة على ذلك، تدهور الحمض النووي الناجم عن المستخدم أثناء عزل الحمض النووي أحد العوائق الرئيسية في استخدام هذه الأساليب. هلام خلية واحدة التفريد (المعروفة بمقايسة المذنب)18،19 و γH2A.X إيمونولابيلينج8 التقنيات هي النهج الأساسية في مختبرات البحوث لتقييم الأضرار في الحمض النووي. هذان الأسلوبان لا تتطلب معدات باهظة الثمن أو عزل الحمض النووي لتحليل الحمض النووي سلامة8،،من2021. منذ ذلك الحين، تم إجراء هذه التقنيات مع خلايا كاملة؛ الحمض النووي/رنا/البروتين تدهور المستحثة بالمستخدم أثناء إعداد عينة لن يؤثر على هذه البروتوكولات. هنا، لتقييم أضرار الحمض النووي والحمض النووي الضرر ردا في الساق والخلايا المشتقة من الخلايا الجذعية، ونحن نقدم البروتوكولات خطوة بخطوة لتنفيذ كلا المذنب المقايسة و γH2A.X إيمونولابيلينج. وعلاوة على ذلك، الجمع بين هذين النهجين، نقترح إجراء تقييم السذاجة التي يمكن استخدامها لتقييم مدى ملاءمتها للخلية لزرع الأعضاء.
مقايسة المذنب، أو خلية واحدة جل التفريد، تدابير فواصل الحمض النووي في الخلايا. يتم تفكيك الخلايا المضمنة في [اغروس] انصهار منخفضة بشكل نوكليويدس التي تحتوي على الحمض النووي سوبيركويليد. عند التفريد، ترحيل قطع صغيرة من الحمض النووي مجزأة وقطع خيوط الحمض النووي عن طريق المسام [اغروس]، حين دنا سليمة، بسبب حجمها الهائل بالاقتران مع البروتين المصفوفة، سيكون هجرة مقيدة. يحاكي نمط الحمض النووي الملون تحت مجهر fluorescence مذنب. رأس المذنب يحتوي على الحمض النووي سليمة وهو يتألف من أجزاء الذيل وكسر خيوط الحمض النووي. ويمكن قياس جزء صغير أضرار الحمض النووي بشدة الأسفار من تلف الحمض النووي (ذيل المذنب) بالنسبة إلى كثافة الحمض النووي (رأس المذنب) سليمة. يمكن حساب هذه اللحظة ذيل معلمة كما هو مبين في الشكل 1.
أضرار الحمض النووي يؤدي إلى الفسفرة هستون H2A. X (γH2A.X) في Ser139 التي مؤنزم ATM و ATR الحمض النووي-PK. الفسفرة وتجنيد H2A. X في فواصل حبلا الحمض النووي يسمى استجابة تلف الحمض النووي (DDR) ويحدث سريعاً بعد أن تلف الحمض النووي. وفي أعقاب هذه العملية، والقبض على نقطة تفتيش بوساطة دورة الخلية والحمض النووي هي بدأت عمليات إصلاح. بعد الانتهاء الناجح لإصلاح الحمض النووي، ديفوسفوريلاتيد γH2A.X وإبطال من فوسفاتاسيس. لفترات طويلة ومتعددة فواصل حبلا الحمض النووي يؤدي إلى تراكم البؤر γH2A.X في الحمض النووي. وهذا يشير إلى عدم التمكن من إصلاح أضرار الحمض النووي وسلامة الحمض النووي للخلية. يمكن تحديد هذه البؤر γH2A.X في الحمض النووي، ويمكن حساب عدد البؤر التسريح وإعادة الإدماج باستخدام البروتوكول في الباب 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
سلامة الحمض النووي يصور سلامة الخلية. الخلايا التي تحتوي على الحمض النووي تضررت كثيرا في الإجهاد وتفقد سلامتها في نهاية المطاف. سلامة الجذعية والخلايا المشتقة من الخلايا الجذعية التي تنتشر غرض الزرع الرئيسي للخلايا لأداء وظيفتها المطلوبة. زرع خلايا بتلف الحمض النووي سيؤدي في معدل انجراف…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل وأيده في الجزء الوطني للقلب والرئة والدم المعهد المنح RO1-HL-99507, HL-114120، HL-131017، HL138023، و UO1-HL-134764 (على تشانغ جيه)، و “جمعية القلب الأمريكية العلمية التنمية منحة” 17SDG33670677 (إلى ر. كانابان).
Materials
| 0.25% Trypsin | Corning | 25200056 | |
| 8-well chamber slide | Millicell | PEZGS0816 | |
| Accutase | Stemcell Technologies | 7920 | Cell detachment solution |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG |
Jackson Immuno Research Laboratories |
711-545-152 (RRID: AB_2313584) |
|
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson Immuno Research Laboratories |
711-165-152 (RRID:AB_2307443) |
|
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9564 | |
| Gibco B-27 Supplement, Serum Free, | Gibco | 17504-044 | |
| Matrigel growth factor reduced | Corning | 354230 | |
| mTeSR1 | Stemcell Technologies | 85850 | |
| PhalloidinA488 | Life Technology | A12379 | |
| Phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody | Cell Signaling Technology | 2577 (RRID: AB_2118010) | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| SYBR Green I nucleic acid gel stain | Sigma-Aldrich | S9430 | |
| Triton X-100 | Fisher scientific | BP151-100 | |
| UltraPure Low melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Antifade |
References
- Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. The Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
- Makkar, R. R., et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. The Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).
- Tomita, Y., et al. Cardiac neural crest cells contribute to the dormant multipotent stem cell in the mammalian heart. Journal of Cell Biology. 170 (7), 1135-1146 (2005).
- Oyama, T., et al. Cardiac side population cells have a potential to migrate and differentiate into cardiomyocytes in vitro and in vivo. Journal of Cell Biology. 176 (3), 329-341 (2007).
- Fischer, K. M., et al. Enhancement of myocardial regeneration through genetic engineering of cardiac progenitor cells expressing Pim-1 kinase. Circulation. 120 (21), 2077-2087 (2009).
- Cottage, C. T., et al. Cardiac progenitor cell cycling stimulated by pim-1 kinase. Circulation Research. 106 (5), 891-901 (2010).
- Angert, D., et al. Repair of the injured adult heart involves new myocytes potentially derived from resident cardiac stem cells. Circulation Research. 108 (10), 1226-1237 (2011).
- Kannappan, R., et al. p53 Modulates the Fate of Cardiac Progenitor Cells Ex vivo and in the Diabetic Heart In vivo. EBioMedicine. 16, 224-237 (2017).
- Hatzistergos, K. E., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells stimulate cardiac stem cell proliferation and differentiation. Circulation Research. 107 (7), 913-922 (2010).
- Okita, K., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: opportunities and challenges. Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1575), 2198-2207 (2011).
- Zhang, J., et al. Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).
- Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
- Zhang, L., et al. Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast. Circulation: Heart Failure. 8 (1), 156-166 (2015).
- Hirakawa, K., Midorikawa, K., Oikawa, S., Kawanishi, S. Carcinogenic semicarbazide induces sequence-specific DNA damage through the generation of reactive oxygen species and the derived organic radicals. Mutation Research. 536 (1-2), 91-101 (2003).
- Martinez, G. R., et al. Oxidative and alkylating damage in DNA. Mutation Research. 544 (2-3), 115-127 (2003).
- Valko, M., Rhodes, C. J., Moncol, J., Izakovic, M., Mazur, M. Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer. Chemico-Biological Interactions. 160 (1), 1-40 (2006).
- Wiseman, H., Halliwell, B. Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer. Biochemical Journal. 313 (Pt 1), 17-29 (1996).
- Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 123 (1), 291-298 (1984).
- Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Experimental Cell Research. 175 (1), 184-191 (1988).
- Goichberg, P., et al. Age-associated defects in EphA2 signaling impair the migration of human cardiac progenitor cells. Circulation. 128 (20), 2211-2223 (2013).
- Kannappan, R., Mattapally, S., Wagle, P. A., Zhang, J. Transactivation domain of p53 regulates DNA repair and integrity in human iPS cells. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. , (2018).
- Al-Baker, E. A., Oshin, M., Hutchison, C. J., Kill, I. R. Analysis of UV-induced damage and repair in young and senescent human dermal fibroblasts using the comet assay. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (6-7), 664-672 (2005).
- Azqueta, A., Gutzkow, K. B., Brunborg, G., Collins, A. R. Towards a more reliable comet assay: optimising agarose concentration, unwinding time and electrophoresis conditions. Mutation Research. 724 (1-2), 41-45 (2011).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), R100 (2006).
- Paradis, A. N., Gay, M. S., Zhang, L. Binucleation of cardiomyocytes: the transition from a proliferative to a terminally differentiated state. Drug Discovery Today. 19 (5), 602-609 (2014).
