Оценки целостности ДНК стволовых клеток для сердечно клеточной терапии
Summary
Здесь мы предоставляем подробное описание экспериментальной установки для анализа оценки целостности ДНК в стволовых клеток до трансплантации клеток.
Abstract
Стебель и стволовых клеток, полученных клетки имеют огромный потенциал как регенеративной терапии для различных дегенеративных заболеваний. ДНК является склад генетических данных во всех клетках, в том числе стволовых клеток, и ее целостность имеет основополагающее значение для его регенеративные способности. Стволовые клетки претерпевают быстрое распространение в лабораториях для достижения необходимого числа для трансплантации. Ускоренное клеточный рост приводит к потере целостности ДНК накопленных метаболитов, таких как кислорода, карбонил и алкилирующие агенты. Пересадка эти клетки приведет к плохой приживления и регенерации органов ухудшение. Кроме того, пересадке ДНК поврежденных клеток приводит к мутации, нестабильность ДНК и клеточного старения и возможно, угрожающих жизни заболеваний, как рак. Таким образом существует настоятельная необходимость для метода контроля качества для оценки пригодности клеток для трансплантации. Здесь мы предоставляем пошаговые протоколы для оценки целостности ДНК стволовых клеток до трансплантации клеток.
Introduction
Экспериментальные и клинические данные показывают, что трансплантация клеток умеренно может улучшить левого желудочка сократительной производительность при отсутствии сердца1,2,3,4,5 ,6,,78,9. Последние достижения открыли дальнейшего обжалования возможности для сердечно-сосудистой системы регенерации; к ним относятся принудительный выражение перепрограммирования факторов в соматических клетках побудить плюрипотентности и дифференцировать эти индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC) в различных линий сердца, главное cardiomyocyte (CM)10, 11 , 12 , 13. Наследственный материал в каждой ячейке, включая искусственно созданные iPSCs и iPSC производные см (iPS см), является ДНК. Генетические инструкции, хранящиеся в ДНК диктует рост, развитие и функции клеток, тканей, органов и организмов. ДНК не является инертным; Мобильный метаболитов, таких как карбонильных кислорода и азота, и алкилирующие агенты могут причина ДНК повреждения в vitro и in vivo в14,,1516,17. Важно отметить, что повреждение ДНК интуитивно происходит в каждой клетке, с частотой значительный. Если эти убытки не исправить, это приведет к мутации ДНК, сотовой старение, потеря целостности ДНК и ячеек, и возможно, заболеваний, включая раковые заболевания, угрожающие жизни. Таким образом сохраняя целостность ДНК имеет важное значение для любой ячейки, особенно iPSCs, которая имеет огромный потенциал в клинике.
Для оценки количества и целостности изолированных геномной ДНК, дорогое оборудование доступны на рынке. Однако не существует простых и экономически эффективных методов для оценки целостности ДНК в клетках без изоляции клеток. Кроме того пользователь ДНК-деградации во время изоляции ДНК является одним из основных недостатков в использовании этих методов. Одноклеточных гель электрофореза (известный как комета пробирного)18,19 и γH2A.X immunolabeling8 методы являются фундаментальные подходы в исследовательских лабораториях для оценки повреждения ДНК. Эти два метода не требуется дорогостоящее оборудование или изолированные геномной ДНК для анализа ДНК целостности8,,2021. Поскольку эти методы были выполнены с всей клетки; пользователя индуцированной деградации ДНК/РНК/белков во время подготовки пробы не будет затрагивать эти протоколы. Здесь чтобы оценить повреждение ДНК и ДНК повреждения ответ в стволовых и стволовых клеток, полученных клеток, мы предоставляем пошаговые протоколы для выполнения как комета пробирного и γH2A.X immunolabeling. Кроме того сочетание этих двух подходов, мы предлагаем наивно оценки, которая может использоваться для оценки пригодности клеток для трансплантации.
Комета пробирного, или одну ячейку электрофорез геля, измеряет разрывы ДНК в клетках. Клетки, встроенные в легкоплавких агарозы лизированы в форме нуклеоидах, содержащих supercoiled ДНК. После электрофореза небольшие кусочки фрагментированных ДНК и сломанной нити ДНК мигрируют через агарозы поры, тогда как нетронутыми ДНК, из-за их огромного размера и конъюгирования их с белками матрицы, будет иметь ограничения миграции. Шаблон окрашенных ДНК под микроскопом флуоресценции имитирует кометы. Голова кометы содержит нетронутыми ДНК и хвост состоит из фрагментов и сломанной нити ДНК. Фракция повреждения ДНК может измеряться по интенсивности флуоресценции поврежденной ДНК (хвост кометы) относительно неизменной интенсивности (голова кометы) ДНК. Данный параметр хвост момент может быть рассчитана, как показано на рисунке 1.
Повреждение ДНК вызывает фосфорилирование гистона Н2А. X (γH2A.X) в Ser139, ATM, ATR и ДНК-PK киназы. Фосфорилирование и вербовка Н2А. X на разрывы ДНК пряди называется ДНК повреждения ответ (РДР) и быстро происходит после повреждения ДНК. Этот процесс, КПП опосредованной клеточного цикла ареста и ДНК инициировал ремонт процессы. После успешного завершения восстановления ДНК γH2A.X dephosphorylated и инактивированных фосфатаз. Длительные и несколько разрывы ДНК пряди приводят к накоплению очагов γH2A.X в ДНК. Это указывает на неспособность ячейки для ремонта повреждений ДНК и потеря целостности ДНК. Эти очаги γH2A.X в ДНК может быть идентифицирован и количество DDR очагов могут быть подсчитаны с использованием протокола в разделе 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Целостность ДНК изображает целостность клеток. Клетки с поврежденной ДНК часто в стресс и в конечном итоге потерять их целостность. Целостность стволовых стволовых клеток, полученных клеток, которые распространяются для целей трансплантации и основных ячеек для выполнения их требуем…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа частично поддержали национальные сердца, легких и крови института грантов RO1-HL-99507, HL-114120, HL-131017, HL138023 и UO1-HL-134764 (с J. Чжан) и американской сердца ассоциации научного развития Грант 17SDG33670677 (до р. Kannappan).
Materials
| 0.25% Trypsin | Corning | 25200056 | |
| 8-well chamber slide | Millicell | PEZGS0816 | |
| Accutase | Stemcell Technologies | 7920 | Cell detachment solution |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG |
Jackson Immuno Research Laboratories |
711-545-152 (RRID: AB_2313584) |
|
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson Immuno Research Laboratories |
711-165-152 (RRID:AB_2307443) |
|
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9564 | |
| Gibco B-27 Supplement, Serum Free, | Gibco | 17504-044 | |
| Matrigel growth factor reduced | Corning | 354230 | |
| mTeSR1 | Stemcell Technologies | 85850 | |
| PhalloidinA488 | Life Technology | A12379 | |
| Phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody | Cell Signaling Technology | 2577 (RRID: AB_2118010) | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| SYBR Green I nucleic acid gel stain | Sigma-Aldrich | S9430 | |
| Triton X-100 | Fisher scientific | BP151-100 | |
| UltraPure Low melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Antifade |
References
- Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. The Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
- Makkar, R. R., et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. The Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).
- Tomita, Y., et al. Cardiac neural crest cells contribute to the dormant multipotent stem cell in the mammalian heart. Journal of Cell Biology. 170 (7), 1135-1146 (2005).
- Oyama, T., et al. Cardiac side population cells have a potential to migrate and differentiate into cardiomyocytes in vitro and in vivo. Journal of Cell Biology. 176 (3), 329-341 (2007).
- Fischer, K. M., et al. Enhancement of myocardial regeneration through genetic engineering of cardiac progenitor cells expressing Pim-1 kinase. Circulation. 120 (21), 2077-2087 (2009).
- Cottage, C. T., et al. Cardiac progenitor cell cycling stimulated by pim-1 kinase. Circulation Research. 106 (5), 891-901 (2010).
- Angert, D., et al. Repair of the injured adult heart involves new myocytes potentially derived from resident cardiac stem cells. Circulation Research. 108 (10), 1226-1237 (2011).
- Kannappan, R., et al. p53 Modulates the Fate of Cardiac Progenitor Cells Ex vivo and in the Diabetic Heart In vivo. EBioMedicine. 16, 224-237 (2017).
- Hatzistergos, K. E., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells stimulate cardiac stem cell proliferation and differentiation. Circulation Research. 107 (7), 913-922 (2010).
- Okita, K., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: opportunities and challenges. Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1575), 2198-2207 (2011).
- Zhang, J., et al. Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).
- Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
- Zhang, L., et al. Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast. Circulation: Heart Failure. 8 (1), 156-166 (2015).
- Hirakawa, K., Midorikawa, K., Oikawa, S., Kawanishi, S. Carcinogenic semicarbazide induces sequence-specific DNA damage through the generation of reactive oxygen species and the derived organic radicals. Mutation Research. 536 (1-2), 91-101 (2003).
- Martinez, G. R., et al. Oxidative and alkylating damage in DNA. Mutation Research. 544 (2-3), 115-127 (2003).
- Valko, M., Rhodes, C. J., Moncol, J., Izakovic, M., Mazur, M. Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer. Chemico-Biological Interactions. 160 (1), 1-40 (2006).
- Wiseman, H., Halliwell, B. Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer. Biochemical Journal. 313 (Pt 1), 17-29 (1996).
- Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 123 (1), 291-298 (1984).
- Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Experimental Cell Research. 175 (1), 184-191 (1988).
- Goichberg, P., et al. Age-associated defects in EphA2 signaling impair the migration of human cardiac progenitor cells. Circulation. 128 (20), 2211-2223 (2013).
- Kannappan, R., Mattapally, S., Wagle, P. A., Zhang, J. Transactivation domain of p53 regulates DNA repair and integrity in human iPS cells. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. , (2018).
- Al-Baker, E. A., Oshin, M., Hutchison, C. J., Kill, I. R. Analysis of UV-induced damage and repair in young and senescent human dermal fibroblasts using the comet assay. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (6-7), 664-672 (2005).
- Azqueta, A., Gutzkow, K. B., Brunborg, G., Collins, A. R. Towards a more reliable comet assay: optimising agarose concentration, unwinding time and electrophoresis conditions. Mutation Research. 724 (1-2), 41-45 (2011).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), R100 (2006).
- Paradis, A. N., Gay, M. S., Zhang, L. Binucleation of cardiomyocytes: the transition from a proliferative to a terminally differentiated state. Drug Discovery Today. 19 (5), 602-609 (2014).
