심장 세포 치료를 위한 줄기 세포 DNA 무결성을 평가

Summary

여기, 우리 세포 이식 전에 줄기 세포에서 DNA 무결성의 평가의 분석 실험 설정에 대 한 자세한 설명을 제공합니다.

Abstract

줄기 줄기 세포 유래 세포는 다양 한 퇴행 성 질환 재생 치료로 서 엄청난 잠재력이 있다. DNA는 줄기 세포를 포함 하 여 모든 셀에서 유전 정보의 창 고입니다 그리고 그것의 무결성은 재생 능력에 기본적 이다. 줄기 세포가 식 위한 필요한 수를 달성 하기 위해 실험실에서 급속 한 전파를 받 다. 빠른된 세포 성장 반응 산소, 생성, 에이전트 alkylating 등 축적 된 대사 산물에 의해 DNA 무결성의 손실에 지도 한다. 이 세포를 이식 가난한 engraftment 및 악화 장기의 재생 발생할 것 이다. 또한, 돌연변이, DNA 불안정, 세포 노화, DNA 손상 세포 리드를 이식 하 고 가능 하 게, 생명이 암 같은 질병. 따라서,이 식 위한 세포의 적합성을 평가 하는 품질 관리 방법에 대 한 즉각적인 필요가 있다. 여기, 우리는 이전에 세포 이식 줄기 세포의 DNA 무결성의 평가 대 한 단계별 프로토콜을 제공합니다.

Introduction

실험 및 임상 증거 세포 이식 적당히 마음^{1,2,,34,5 실패의 좌 심 실 수축 성능을 향상 시킬 수 보여줍니다. ,6,7,,89}. 최근 진보 심혈 관 재생;에 대 한 기회를 더 매력적인 연 이러한 체세포 pluripotency 유도 다른 심장 계보, 중요 한 것은 cardiomyocyte (CM)^10, 으로이 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)를 구분 하기에 재활 요인의 강제 식 포함 ^{11 , 12 , 13}. 인위적으로 생성 된 Ipsc, iPSC 파생 CM (iPS-CM)를 포함 하 여 모든 세포에서 유전 물질은 DNA. DNA에 저장 된 유전 지시 지시 성장, 개발 및 셀, 조직, 장기, 그리고 유기 체 기능. DNA는 불활성; 세포 대사 산물, 반응성 산소, 생성, 질소 종 등 하 고 에이전트 alkylating 손상 될 수 있습니다 원인 DNA 생체 외에서 그리고 vivo에서^14,15,,1617. 중요 한 것은, DNA 손상 중요 한 주파수를 가진 모든 셀에 직관적으로 발생합니다. 경우 이러한 손해는 해결 되지 않으면, 그것은 DNA 돌연변이, 세포 노화, DNA와 세포 무결성, 그리고 아마도, 질병, 생명을 위협 하는 암 등의 손실 이어질 것입니다. 따라서, DNA 무결성 유지 특히 Ipsc, 병원에서 엄청난 잠재력을 가진 어떤 셀에 필수적 이다.

수량 및 고립 된 게놈 DNA의 무결성을 평가, 고가의 장비 시장에 유효 하다. 그러나, 셀을 분리 하지 않고 셀에 DNA 무결성을 평가 하기 위해 아무 간단 하 고 비용 효율적인 방법이 있다. 또한, DNA 분리 하는 동안 DNA 저하 사용자 유도 이러한 메서드를 사용 하 여 주요 단점 중 하나입니다. 단일 셀 젤 전기 이동 법 (혜성 분석 결과 라고도 함)^18,19 와 γH2A.X immunolabeling⁸ 기술 연구 실험실에서 DNA 손상 평가 대 한 근본적인 접근 있습니다. 이러한 두 가지 방법 고가의 장비 또는 DNA 무결성^8,,2021분석 하 고립 된 게놈 DNA를 필요 하지 않습니다. 이후, 이러한 기술은 전체 셀; 수행 되었습니다. 샘플 준비 하는 동안 사용자 유도 DNA/RNA/단백질 저하는 이러한 프로토콜에 영향을 미치지 않습니다. 여기, DNA 손상 및 줄기와 줄기 세포 유래 세포에서 DNA 손상 응답 평가, 우리 혜성 분석 결과 및 γH2A.X immunolabeling를 모두 수행 하는 단계별 프로토콜을 제공 합니다. 또한, 결합이 두 가지 방법, 제안 한다 순진한 평가 이식에 대 한 셀의 적합성을 평가 하는 데 사용할 수 있습니다.

혜성 분석 결과, 또는 단일 셀 젤 전기 이동 법, 세포에서 DNA 나누기를 측정 한다. 낮은 녹는 agarose에 포함 된 셀은 supercoiled DNA를 포함 하는 양식 nucleoids을 lysed. 전기 이동 법, 그들의 거 대 한 크기와 매트릭스 단백질 그들의 활용 그대로 DNA 제한 마이그레이션 갖습니다 반면 agarose 숨 구멍을 통해 작은 조각 조각난된 DNA와 깨진된 DNA 가닥의 마이그레이션합니다. 형광 현미경으로 얼룩진된 DNA의 패턴은 혜성을 모방합니다. 그대로 DNA를 포함 하는 혜성 머리와 꼬리 조각의 구성 및 고장 DNA 가닥. DNA 손상의 분수는 그대로 DNA (혜성 머리) 강도 기준으로 손상 된 DNA (혜성 꼬리)의 형광 강도 의해 측정할 수 있습니다. 그림 1과 같이 매개 변수 꼬리 순간을 계산할 수 있습니다.

DNA 손상 히스톤 H2A의 인 산화를 유도 한다. ATM, ATR, 및 DNA-PK kinases 여 Ser139에서 (γH2A.X) X. 인 산화 그리고 H2A의 모집입니다. DNA 가닥 나누기에서 X DNA 손상 응답 (DDR) 이라고 하 고 DNA 손상 후 급속 하 게 일어난다. 이 과정, 세포 주기 검문소 중재 체포 및 DNA 복구 프로세스가 시작 됩니다. DNA 수리 완료 후 γH2A.X dephosphorylated 이며 가수분해에 의해 비활성화. 연장 하 고 여러 개의 DNA 가닥 나누기 DNA에 γH2A.X foci의 축적으로 이어질. 이 DNA 손상 및 DNA 무결성의 손실 복구 하 셀의 무 능력을 나타냅니다. 이러한 γH2A.X foci DNA에 의해 확인 될 수 있다 그리고 2 절에서 프로토콜을 사용 하 여 DDR foci의 수를 계산 하실 수 있습니다.

Protocol

1. 혜성 분석 결과 시 약 준비 낮은 용 해 점 agarose 낮은 녹는 agarose의 500 mg 100 ml의 DNA-장소/물 RNA-무료. agarose를 녹이 고 때까지 전자 레인지에서 병을 열. 37 ° C 물 목욕까지 필요에 병을 배치 합니다.참고: 추가 읽기를 위해 Azqueta 그 외 여러분, DNA 해제 시간 및 여러 전기 요소23agarose 농도의 영향을 공부한 참조. 재고 염료 솔루?…

Representative Results

인간 유도 만능 줄기 세포를 배양 하 고 DNA 무결성의 측정으로 사용 되었다, DNA 손상 및 꼬리 순간 혜성 분석 결과 의해 분석 되었다. iPS 세포는 낮은 녹는 점 agarose에 포함 되었고 유리 슬라이드에 배치. 셀, 다음, 세포의 용 해 버퍼, 이어서 supercoiled DNA를 알칼리 성 해결책으로 취급 됩니다. Nucleoids electrophoresed 했다 고 혜성 DNA 염료 (그림 1A-D</str…

Discussion

DNA 무결성을 셀 무결성을 그렸다. 손상된 DNA와 세포 스트레스에 자주 하 고 결국 그들의 완전성을 잃고. 줄기와 줄기 세포 유래 세포 이식 목적으로 전파 되 고 되는 그들의 원하는 기능을 수행 하는 셀에 대 한 주은. 손상된 DNA와 세포 이식 셀^8,20의 성능과 가난한 engraftment 속도 발생할 것 이다. 따라서, 세포 이식 전에 DNA 무결성 검사는 필요한 품질 관리…

Materials

0.25% Trypsin	Corning	25200056
8-well chamber slide	Millicell	PEZGS0816
Accutase	Stemcell Technologies	7920	Cell detachment solution
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson Immuno Research Laboratories	711-545-152 (RRID: AB_2313584)
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson Immuno Research Laboratories	711-165-152 (RRID:AB_2307443)
DAPI	Sigma-Aldrich	D9564
Gibco B-27 Supplement, Serum Free,	Gibco	17504-044
Matrigel growth factor reduced	Corning	354230
mTeSR1	Stemcell Technologies	85850
PhalloidinA488	Life Technology	A12379
Phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody	Cell Signaling Technology	2577 (RRID: AB_2118010)
RPMI	Gibco	11875-093
SYBR Green I nucleic acid gel stain	Sigma-Aldrich	S9430
Triton X-100	Fisher scientific	BP151-100
UltraPure Low melting Point Agarose	Invitrogen	16520050
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000	Antifade