Avaliar a integridade do DNA de células-tronco para terapia celular cardíaca
Summary
Aqui, nós fornecemos uma descrição detalhada de uma instalação experimental para uma análise da avaliação da integridade do DNA em células antes do transplante de células-tronco.
Abstract
Tronco e células tronco-células-derivadas têm imenso potencial como uma terapia regenerativa para várias doenças degenerativas. DNA é o armazém de dados genéticos em todas as células, incluindo células-tronco, e sua integridade é fundamental para a sua capacidade de regeneração. Células-tronco passam por propagação rápida em laboratórios para alcançar os números necessários para transplante. Crescimento acelerado celular leva à perda da integridade do DNA por metabólitos acumulados, como reativas de oxigênio, carbonila e agentes alquilantes. Estas células de transplantação resultaria em enxertia pobre e regeneração do órgão se deteriorando. Além disso, transplante de células de DNA danificado leva a mutações, instabilidade do DNA, senescência celular e possivelmente, fatais doenças como o câncer. Portanto, há uma necessidade imediata de um método de controle de qualidade avaliar a adequação da célula para transplante. Aqui, nós fornecemos protocolos passo a passo para a avaliação da integridade da DNA de células antes do transplante de células-tronco.
Introduction
Evidências experimentais e clínicas demonstra que o transplante de células moderadamente pode melhorar o desempenho contrátil do ventrículo esquerdo de falhando corações1,2,3,4,5 ,6,7,8,9. Avanços recentes abriram ainda mais atraentes oportunidades de regeneração cardiovascular; Estes incluem a expressão forçada de reprogramação fatores em células somáticas para induzir a pluripotência e diferenciar essas células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) em diferentes linhagens cardíacas, importante casos (CM)10, 11 , 12 , 13. o material hereditário em todas as células, incluindo os artificialmente gerado iPSCs e derivado de iPSC CM (iPS-CM), é DNA. Instruções genéticas armazenadas no DNA dita o crescimento, desenvolvimento e função de células, tecidos, órgãos e organismos. DNA não é inerte; metabólitos, tais como reativas de oxigênio, carbonila e espécies de nitrogênio, de células e agentes alquilantes pode DNA causa danos in vitro e in vivo14,15,16,17. Importante, o dano ao DNA ocorre intuitivamente em cada célula, com uma frequência significativa. Se esses danos não são corrigidos, conduzirá a mutação de DNA, senescência celular, a perda da integridade do DNA e células e possivelmente, doenças, incluindo câncer fatal. Portanto, mantendo a integridade do DNA é essencial para qualquer célula, especialmente iPSCs, que tem um enorme potencial na clínica.
Para avaliar a quantidade e a integridade do DNA genômico de isolados, equipamento caro está disponível no mercado. No entanto, não há nenhum método simples e econômico para avaliar a integridade do DNA nas células sem isolar as células. Além disso, degradação de DNA induzida pelo usuário durante o isolamento do DNA é uma das principais desvantagens em usar esses métodos. O gel de célula única eletroforese (conhecido como ensaio cometa)18,19 e γH2A.X immunolabeling8 técnicas é abordagens fundamentais em laboratórios de pesquisa para avaliar o dano do ADN. Esses dois métodos não exigem equipamentos caros ou DNA genômico isolado para analisar DNA integridade8,20,21. Desde então, estas técnicas têm sido realizadas com células toda; degradação de DNA/RNA/proteína induzida pelo usuário durante a preparação da amostra não afetará a esses protocolos. Aqui, para avaliar os danos ao DNA e resposta de dano do ADN no tronco e células tronco-células-derivadas, nós fornecemos protocolos passo a passo para executar tanto o cometa do ensaio e γH2A.X immunolabeling. Além disso, combinando essas duas abordagens, propomos uma avaliação ingênua que pode ser usada para avaliar a adequação da célula para transplante.
O ensaio cometa, ou célula única electroforese do gel, mede as quebras de DNA nas células. Incorporado em agarose de baixo ponto de fusão de células lysed para nucleoids de formulário contendo DNA supercoiled. Após eletroforese, pequenos pedaços de DNA fragmentado e fios quebrados de DNA migram através dos poros de agarose, Considerando que o DNA intacto, devido ao seu enorme tamanho e sua conjugação com a proteína da matriz, terá uma migração restrita. O padrão de DNA manchada sob um microscópio de fluorescência imita um cometa. A cabeça do cometa contém DNA intacto e a cauda é composta de fragmentos de quebrar cadeias de ADN. A fração de dano do ADN pode ser medida pela intensidade da fluorescência do DNA danificado (cauda de cometa) em relação a intensidade de (cabeça de cometa) de DNA intacta. O momento de cauda do parâmetro pode ser calculado como mostrado na Figura 1.
Danos ao DNA induz a fosforilação de histona H2A. X (γH2A.X) no Ser139 por quinases ATM, ATR e DNA-PK. A fosforilação e o recrutamento da H2A. X em quebras da cadeia de ADN é chamada de resposta de dano de DNA (DDR) e acontece rapidamente depois que o DNA é danificado. Após este processo, detenção de ciclo de celular mediada por ponto de verificação e DNA são iniciados os processos de reparação. Após a conclusão bem-sucedida de reparação do ADN, γH2A.X é dephosphorylated e inativado por fosfatases. Prolongada e múltiplas quebras DNA levam ao acúmulo de focos γH2A.X no DNA. Isto indica a incapacidade da célula para reparar os danos do DNA e a perda da integridade do DNA. Estes focos γH2A.X no DNA podem ser identificados por… e o número de focos DDR pode ser contado usando o protocolo na secção 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Integridade do DNA retrata a integridade celular. Células com DNA danificado são frequentemente em stress e eventualmente perdem sua integridade. A integridade do tronco e células tronco-derivado de células que estão sendo propagadas para fins de transplante é principal para as células executar sua função pretendida. Transplante de células com DNA danificado resultaria em uma taxa de enxertia pobre e desempenho da célula8,20. Por conseguinte, examinar …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado em parte pelo nacional do coração, pulmão e sangue Instituto bolsas RO1-HL-99507, HL-114120, HL-131017, HL138023 e UO1-HL-134764 (para J. Zhang) e pela American coração Associação científica desenvolvimento Grant 17SDG33670677 (a. R. Kannappan).
Materials
| 0.25% Trypsin | Corning | 25200056 | |
| 8-well chamber slide | Millicell | PEZGS0816 | |
| Accutase | Stemcell Technologies | 7920 | Cell detachment solution |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG |
Jackson Immuno Research Laboratories |
711-545-152 (RRID: AB_2313584) |
|
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson Immuno Research Laboratories |
711-165-152 (RRID:AB_2307443) |
|
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9564 | |
| Gibco B-27 Supplement, Serum Free, | Gibco | 17504-044 | |
| Matrigel growth factor reduced | Corning | 354230 | |
| mTeSR1 | Stemcell Technologies | 85850 | |
| PhalloidinA488 | Life Technology | A12379 | |
| Phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody | Cell Signaling Technology | 2577 (RRID: AB_2118010) | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| SYBR Green I nucleic acid gel stain | Sigma-Aldrich | S9430 | |
| Triton X-100 | Fisher scientific | BP151-100 | |
| UltraPure Low melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Antifade |
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