心臓の細胞治療幹細胞 DNA の完全性を評価します。
Summary
ここでは、幹細胞移植前の DNA の完全性の評価分析のため実験のセットアップの詳細な説明を提供します。
Abstract
幹と幹細胞由来細胞様々 な変性疾患の再生治療として大きな可能性があります。DNA は、幹細胞を含むすべてのセル内の遺伝データの倉庫との整合性はその再生能力の基本。幹細胞移植のための必要な数を達成するためにラボでの急速な伝播を受けます。加速された細胞の成長は活性酸素、カルボニル、アルキル化剤など、蓄積した代謝物による DNA の完全性の損失につながります。これらの細胞を移植生着不全と悪化の器官の再生になります。また、突然変異、dna、細胞老化細胞の DNA 損傷リードを移植とおそらく、生命を脅かすがんなどの病気。したがって、移植細胞の適合性を評価するための品質管理法のための即時の必要性があります。ここでは、幹細胞移植前の DNA の完全性の評価手順のプロトコルを提供します。
Introduction
実験的ならびに臨床的細胞移植することができます心1,2,3,4,5 を失敗して左心室収縮性能を改善して適度に示します ,6,7,8,9。最近の進歩は、心血管の再生のための機会をさらに魅力的な開いています。体細胞に多能性を誘導し、異なる心臓系統、重要な心筋細胞 (CM)10、にこれらの誘導多能性幹細胞 (iPSC) を区別するためにリプログラミング因子の強制発現が含まれます11,12,13。 人工的に生成された Ips と iPSC 由来 CM (iPS CM)、などを含むすべてのセルの遺伝性材料の DNA です。DNA に格納されている遺伝命令は、成長、開発、および細胞、組織、器官、生物の機能を決定します。DNA ではない不活性です。細胞の代謝、活性酸素、カルボニル、窒素種などとアルキル化剤は原因 DNA の in vitro および in vivo で14,15,16,17を傷つけることができます。重要なは、重要な頻度のすべてのセルで直感的に DNA 損傷が発生します。これらの損傷が修正されていない場合それは DNA の突然変異、細胞の老化、DNA ・細胞の整合性、および多分、生命を脅かす癌を含む疾患の損失に します。したがって、DNA の整合性を維持する任意のセル、特にクリニックの巨大な潜在性を持つ Ips に不可欠です。
数量やゲノムの DNA の分離の整合性を評価する高価な機器は市場で利用できます。ただし、セルを孤立させることがなく細胞内 DNA の整合性を評価するためにシンプルでコスト効率の良い方法もありません。さらに、ユーザーによる DNA 分解 DNA の隔離は、これらのメソッドを使用して主な欠点の 1 つです。単細胞ゲル電気泳動 (コメット試験法として知られている)18,19と γH2A.X 反応8テクニックは、DNA 損傷を評価するための研究所の根本的なアプローチ。これらの 2 つの方法では、高価な機器や DNA 整合性8,20,21を分析するゲノム DNA の分離は必要ありません。全体のセル; これらの技術で実行されましたので、サンプル準備の間に DNA、RNA、タンパク質分解のユーザー誘導は、これらのプロトコルには影響を与えません。ここでは、DNA 損傷と幹と幹細胞由来細胞における DNA 損傷応答を査定する、彗星法と γH2A.X 反応の両方を実行するステップバイ ステップのプロトコルを提供します。また、これらの 2 つのアプローチを組み合わせて、移植細胞の適合性を評価するために使用できます素朴な評価を提案します。
コメットアッセイ、または単一セルの電気泳動のゲル、細胞での DNA 切断を測定します。低融点アガロースに埋め込まれた細胞は、スーパー コイル DNA を含むフォーム ユーグレナグラシリスに分離します。彼らの巨大なサイズとマトリックス蛋白質とその活用のため、そのまま DNA は制限された移行を持っているに対し電気泳動に断片化された DNA と壊れた dna の小さな断片はアガロースゲル細孔に移行します。蛍光顕微鏡下でステンド グラスの DNA のパターンは、彗星を模倣します。彗星の頭にそのままな DNA が含まれていると尾を断片で構成され、壊れた dna。DNA 損傷の割合は、そのまま DNA (彗星頭部) 強度を基準にして損傷した DNA (彗星の尾) の蛍光強度が測定できます。図 1に示すように、パラメーター テール モーメントを計算できます。
DNA 損傷は、ヒストン H2A のリン酸化を誘導します。DNA PK、ATR、ATM キナーゼ (γH2A.X) を Ser139 で X。リン酸化と H2A の募集。DNA 鎖切断に X は、DNA 損傷応答 (DDR) と呼び、DNA が破損している後急速に起こる。次のこのプロセス、細胞周期のチェックポイントを介した逮捕、DNA 修復プロセスが開始されます。DNA の修復が正常に完了した後、γH2A.X は脱燐酸化し、脱燐酸化酵素による不活化します。長時間、複数の DNA 鎖切断は、dna γH2A.X 巣の蓄積に 。これは、DNA 損傷と DNA の完全性の損失を修復する細胞のできないことを示します。DNA のこれらの γH2A.X の巣によって識別できます、セクション 2 のプロトコルを使用して DDR 巣の数を数えることができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA の完全性は、細胞の完全性を描いています。損傷 DNA と細胞ストレスが多いし、最終的にその整合性を失います。幹と幹細胞由来の細胞が移植を目的として伝達されているの整合性は、その目的の機能を実行するセルのプリンシパルです。損傷 DNA と細胞移植生着不全率と細胞8,20のパフォーマンスになります。したがって、細胞移植前に DNA の検…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、国立心臓、肺、血液研究所助成金 RO1-HL-99507、によって部分で支えられた HL-114120 UO1 HL-134764 (j. 張) に、HL138023、HL 131017、アメリカ心臓協会の科学的な開発補助金 17SDG33670677 (R. Kannappan) します。
Materials
| 0.25% Trypsin | Corning | 25200056 | |
| 8-well chamber slide | Millicell | PEZGS0816 | |
| Accutase | Stemcell Technologies | 7920 | Cell detachment solution |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG |
Jackson Immuno Research Laboratories |
711-545-152 (RRID: AB_2313584) |
|
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson Immuno Research Laboratories |
711-165-152 (RRID:AB_2307443) |
|
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9564 | |
| Gibco B-27 Supplement, Serum Free, | Gibco | 17504-044 | |
| Matrigel growth factor reduced | Corning | 354230 | |
| mTeSR1 | Stemcell Technologies | 85850 | |
| PhalloidinA488 | Life Technology | A12379 | |
| Phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody | Cell Signaling Technology | 2577 (RRID: AB_2118010) | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| SYBR Green I nucleic acid gel stain | Sigma-Aldrich | S9430 | |
| Triton X-100 | Fisher scientific | BP151-100 | |
| UltraPure Low melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Antifade |
References
- Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. The Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
- Makkar, R. R., et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. The Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).
- Tomita, Y., et al. Cardiac neural crest cells contribute to the dormant multipotent stem cell in the mammalian heart. Journal of Cell Biology. 170 (7), 1135-1146 (2005).
- Oyama, T., et al. Cardiac side population cells have a potential to migrate and differentiate into cardiomyocytes in vitro and in vivo. Journal of Cell Biology. 176 (3), 329-341 (2007).
- Fischer, K. M., et al. Enhancement of myocardial regeneration through genetic engineering of cardiac progenitor cells expressing Pim-1 kinase. Circulation. 120 (21), 2077-2087 (2009).
- Cottage, C. T., et al. Cardiac progenitor cell cycling stimulated by pim-1 kinase. Circulation Research. 106 (5), 891-901 (2010).
- Angert, D., et al. Repair of the injured adult heart involves new myocytes potentially derived from resident cardiac stem cells. Circulation Research. 108 (10), 1226-1237 (2011).
- Kannappan, R., et al. p53 Modulates the Fate of Cardiac Progenitor Cells Ex vivo and in the Diabetic Heart In vivo. EBioMedicine. 16, 224-237 (2017).
- Hatzistergos, K. E., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells stimulate cardiac stem cell proliferation and differentiation. Circulation Research. 107 (7), 913-922 (2010).
- Okita, K., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: opportunities and challenges. Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1575), 2198-2207 (2011).
- Zhang, J., et al. Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).
- Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
- Zhang, L., et al. Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast. Circulation: Heart Failure. 8 (1), 156-166 (2015).
- Hirakawa, K., Midorikawa, K., Oikawa, S., Kawanishi, S. Carcinogenic semicarbazide induces sequence-specific DNA damage through the generation of reactive oxygen species and the derived organic radicals. Mutation Research. 536 (1-2), 91-101 (2003).
- Martinez, G. R., et al. Oxidative and alkylating damage in DNA. Mutation Research. 544 (2-3), 115-127 (2003).
- Valko, M., Rhodes, C. J., Moncol, J., Izakovic, M., Mazur, M. Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer. Chemico-Biological Interactions. 160 (1), 1-40 (2006).
- Wiseman, H., Halliwell, B. Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer. Biochemical Journal. 313 (Pt 1), 17-29 (1996).
- Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 123 (1), 291-298 (1984).
- Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Experimental Cell Research. 175 (1), 184-191 (1988).
- Goichberg, P., et al. Age-associated defects in EphA2 signaling impair the migration of human cardiac progenitor cells. Circulation. 128 (20), 2211-2223 (2013).
- Kannappan, R., Mattapally, S., Wagle, P. A., Zhang, J. Transactivation domain of p53 regulates DNA repair and integrity in human iPS cells. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. , (2018).
- Al-Baker, E. A., Oshin, M., Hutchison, C. J., Kill, I. R. Analysis of UV-induced damage and repair in young and senescent human dermal fibroblasts using the comet assay. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (6-7), 664-672 (2005).
- Azqueta, A., Gutzkow, K. B., Brunborg, G., Collins, A. R. Towards a more reliable comet assay: optimising agarose concentration, unwinding time and electrophoresis conditions. Mutation Research. 724 (1-2), 41-45 (2011).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), R100 (2006).
- Paradis, A. N., Gay, M. S., Zhang, L. Binucleation of cardiomyocytes: the transition from a proliferative to a terminally differentiated state. Drug Discovery Today. 19 (5), 602-609 (2014).
