Vurdering af stamceller DNA integritet for kardiale celleterapi
Summary
Her give vi en detaljeret beskrivelse af en eksperimentel opsætning for en analyse af vurderingen af DNA integritet i stamceller inden celle transplantation.
Abstract
Stammen og stammen-celle-afledte celler har enorme potentiale som en regenerativ behandling af forskellige degenerative sygdomme. DNA er lagerbygning af genetiske data i alle celler, herunder stamceller, og dens integritet er grundlæggende for sin regenerative evne. Stamceller undergår hurtige formering i labs for at opnå de nødvendige tal til transplantation. Accelereret cellevækst fører til tab af DNA integritet af akkumulerede metabolitter, såsom reaktive oxygen, carbonyl og alkylerende stoffer. Omplantning disse celler ville resultere i dårlig engraftment og regenerering af den forværrede orgel. Derudover omplantning DNA-beskadigede celler fører til mutationer, DNA ustabilitet, cellulære ældning, og eventuelt livstruende sygdomme som kræft. Derfor, der er et øjeblikkeligt behov for en kvalitetskontrol metode til at vurdere den celle er egnet til transplantation. Her, leverer vi en trinvis protokoller for vurdering af DNA integriteten af stamceller inden celle transplantation.
Introduction
Eksperimentel og klinisk dokumentation viser, at celle transplantation kan moderat forbedre venstre ventrikel kontraktile svigtende hjerter1,2,3,4,5 ,6,7,8,9. De seneste fremskridt har åbnet yderligere tiltrækkende muligheder for hjerte-kar-regenerering; Disse omfatter den tvungne udtryk for omprogrammering faktorer i somatiske celler til at fremkalde pluripotency og differentiere disse inducerede pluripotente stamceller (iPSC) i forskellige kardiale lineages, især cardiomyocyte (CM)10, 11 , 12 , 13. den arvelige materiale i hver celle, herunder kunstigt genereret iPSCs og iPSC-afledte CM (iPS-CM), er DNA. De genetiske instruktioner lagret i DNA dikterer vækst, udvikling og funktion af celler, væv, organer og organismer. DNA er ikke inaktiv; celle metabolitter, såsom reaktive oxygen, carbonyl og nitrogen arter, og alkylerende stoffer kan forårsage DNA skade in vitro- og in vivo14,15,16,17. Vigtigere, opstår DNA-skader intuitivt i hver celle, med en betydelig frekvens. Hvis disse skader ikke er løst, vil det føre til DNA-mutation, cellulære gulne, tabet af DNA og celle integritet, og eventuelt, sygdomme, herunder livstruende kræft. Derfor er bevarer DNA integritet afgørende for enhver celle, især iPSCs, der har et enormt potentiale i klinikken.
For at vurdere den mængde og integritet på isolerede genomisk DNA, er dyrt udstyr tilgængelige på markedet. Men der er ingen enkle og omkostningseffektive metoder til at vurdere DNA integritet i celler, uden at isolere cellerne. Derudover er bruger-induceret DNA nedbrydning under DNA isolation en af de større ulemper ved at bruge disse metoder. De encellede gel elektroforese (kendt som comet assay)18,19 og γH2A.X immunolabeling8 teknikker er grundlæggende metoder i forskning labs for vurdering af DNA-skader. Disse to metoder kræver ikke dyrt udstyr eller isolerede genomisk DNA til at analysere DNA integritet8,20,21. Da er disse teknikker blevet udført med hele celler; bruger-induceret DNA/RNA/protein nedbrydning under prøveforberedelsen vil ikke påvirke disse protokoller. Her, for at vurdere de DNA-skader og DNA skader svar i stammen og stammen-celle-afledte celler, leverer vi en trinvis protokoller til at udføre både komet assay og γH2A.X immunolabeling. Derudover foreslår kombinerer disse to tilgange, vi en naiv vurdering, der kan bruges til at vurdere den celle er egnet til transplantation.
Komet assay, eller enkelt celle gel elektroforese, måler DNA pauser i celler. Celler indlejret i lav-smeltende Agarosen er mængden til form Xanthophyta indeholdende supercoiled DNA. Ved elektroforese vandrer små stykker af fragmenterede DNA og DNA-strenge, brudt gennem porerne Agarosen intakt DNA, på grund af deres enorme størrelse og deres konjugering med matrix protein, vil have en begrænset migration. Mønster af farvede DNA under et fluorescens mikroskop efterligner en komet. Komet hovedet indeholder intakt DNA og halen er sammensat af brudstykker og brudt DNA-strenge. Brøkdel af DNA-skader kan måles ved fluorescens-intensiteten af den beskadigede DNA (comet hale) i forhold til intakt DNA (comet hoved) intensiteten. Parameter halen øjeblik kan beregnes som vist i figur 1.
DNA-skader inducerer fosforylering af Histon H2A. X (γH2A.X) på Ser139 ved ATM, ATR og DNA-PK kinaser. Fosforylering og rekruttering af H2A. X på DNA strand pauser kaldes DNA skader svar (DDR) og sker hurtigt efter DNA er beskadiget. Efter denne proces, checkpoint-medieret celle cyklus anholdelse og DNA reparationsprocesser er indledt. Efter den vellykkede afslutning af DNA reparation, er γH2A.X defosforyleret og inaktiveret ved fosfataser. Forlænget og flere DNA strand pauser føre til ophobning af γH2A.X foci i DNA. Dette angiver cellens evne til at reparere DNA skader og tab af DNA integritet. Disse γH2A.X foci i DNA kan identificeres af og antallet af DDR foci kan tælles ved hjælp af protokollen i afsnit 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA integritet skildrer celle integritet. Celler med beskadiget DNA er ofte i stress og i sidste ende miste deres integritet. Integriteten af stammen og stammen-celle-afledte celler, som overføres til transplantation er vigtigste for cellerne til at udføre deres ønskede funktion. Transplantation af celler med beskadiget DNA ville resultere i en dårlig engraftment hastighed og ydeevne af celle8,20. Derfor er undersøger DNA integritet før celle transplantatio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet i en del af National Heart, Lung, og Blood Institute tilskud RO1-HL-99507, HL-114120, HL-131017, HL138023 og UO1-HL-134764 (til J. Zhang) og af American Heart Association videnskabelige udvikling Grant 17SDG33670677 (til R. Lars).
Materials
| 0.25% Trypsin | Corning | 25200056 | |
| 8-well chamber slide | Millicell | PEZGS0816 | |
| Accutase | Stemcell Technologies | 7920 | Cell detachment solution |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG |
Jackson Immuno Research Laboratories |
711-545-152 (RRID: AB_2313584) |
|
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson Immuno Research Laboratories |
711-165-152 (RRID:AB_2307443) |
|
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9564 | |
| Gibco B-27 Supplement, Serum Free, | Gibco | 17504-044 | |
| Matrigel growth factor reduced | Corning | 354230 | |
| mTeSR1 | Stemcell Technologies | 85850 | |
| PhalloidinA488 | Life Technology | A12379 | |
| Phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody | Cell Signaling Technology | 2577 (RRID: AB_2118010) | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| SYBR Green I nucleic acid gel stain | Sigma-Aldrich | S9430 | |
| Triton X-100 | Fisher scientific | BP151-100 | |
| UltraPure Low melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Antifade |
References
- Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. The Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
- Makkar, R. R., et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. The Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).
- Tomita, Y., et al. Cardiac neural crest cells contribute to the dormant multipotent stem cell in the mammalian heart. Journal of Cell Biology. 170 (7), 1135-1146 (2005).
- Oyama, T., et al. Cardiac side population cells have a potential to migrate and differentiate into cardiomyocytes in vitro and in vivo. Journal of Cell Biology. 176 (3), 329-341 (2007).
- Fischer, K. M., et al. Enhancement of myocardial regeneration through genetic engineering of cardiac progenitor cells expressing Pim-1 kinase. Circulation. 120 (21), 2077-2087 (2009).
- Cottage, C. T., et al. Cardiac progenitor cell cycling stimulated by pim-1 kinase. Circulation Research. 106 (5), 891-901 (2010).
- Angert, D., et al. Repair of the injured adult heart involves new myocytes potentially derived from resident cardiac stem cells. Circulation Research. 108 (10), 1226-1237 (2011).
- Kannappan, R., et al. p53 Modulates the Fate of Cardiac Progenitor Cells Ex vivo and in the Diabetic Heart In vivo. EBioMedicine. 16, 224-237 (2017).
- Hatzistergos, K. E., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells stimulate cardiac stem cell proliferation and differentiation. Circulation Research. 107 (7), 913-922 (2010).
- Okita, K., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: opportunities and challenges. Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1575), 2198-2207 (2011).
- Zhang, J., et al. Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).
- Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
- Zhang, L., et al. Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast. Circulation: Heart Failure. 8 (1), 156-166 (2015).
- Hirakawa, K., Midorikawa, K., Oikawa, S., Kawanishi, S. Carcinogenic semicarbazide induces sequence-specific DNA damage through the generation of reactive oxygen species and the derived organic radicals. Mutation Research. 536 (1-2), 91-101 (2003).
- Martinez, G. R., et al. Oxidative and alkylating damage in DNA. Mutation Research. 544 (2-3), 115-127 (2003).
- Valko, M., Rhodes, C. J., Moncol, J., Izakovic, M., Mazur, M. Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer. Chemico-Biological Interactions. 160 (1), 1-40 (2006).
- Wiseman, H., Halliwell, B. Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer. Biochemical Journal. 313 (Pt 1), 17-29 (1996).
- Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 123 (1), 291-298 (1984).
- Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Experimental Cell Research. 175 (1), 184-191 (1988).
- Goichberg, P., et al. Age-associated defects in EphA2 signaling impair the migration of human cardiac progenitor cells. Circulation. 128 (20), 2211-2223 (2013).
- Kannappan, R., Mattapally, S., Wagle, P. A., Zhang, J. Transactivation domain of p53 regulates DNA repair and integrity in human iPS cells. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. , (2018).
- Al-Baker, E. A., Oshin, M., Hutchison, C. J., Kill, I. R. Analysis of UV-induced damage and repair in young and senescent human dermal fibroblasts using the comet assay. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (6-7), 664-672 (2005).
- Azqueta, A., Gutzkow, K. B., Brunborg, G., Collins, A. R. Towards a more reliable comet assay: optimising agarose concentration, unwinding time and electrophoresis conditions. Mutation Research. 724 (1-2), 41-45 (2011).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), R100 (2006).
- Paradis, A. N., Gay, M. S., Zhang, L. Binucleation of cardiomyocytes: the transition from a proliferative to a terminally differentiated state. Drug Discovery Today. 19 (5), 602-609 (2014).
