Summary

Évaluer l’intégrité de l’ADN de cellules souches pour la thérapie cellulaire cardiaque

Published: January 25, 2019
doi:

Summary

Ici, nous fournir une description détaillée d’un montage expérimental pour une analyse de l’évaluation de l’intégrité de l’ADN dans les cellules avant la transplantation de cellules souches.

Abstract

Tige et cellules cellules souches dérivées ont un potentiel immense comme une thérapie régénératrice pour diverses maladies dégénératives. L’ADN est l’entrepôt de données génétiques dans toutes les cellules, y compris les cellules souches, et son intégrité est fondamentale pour sa capacité régénératrice. Cellules souches subissent une propagation rapide dans les laboratoires pour obtenir les numéros nécessaires à la transplantation. La croissance cellulaire accélérée conduit à la perte d’intégrité de l’ADN par des métabolites accumulés, comme réactives de l’oxygène, carbonyle et des agents alkylants. La transplantation de ces cellules se traduirait par la mauvaise prise de greffe et régénération de l’orgue de détérioration. Repiquage en outre, les cellules endommagées par ADN conduit à des mutations, l’instabilité de l’ADN, la sénescence cellulaire et éventuellement mortelles maladies comme le cancer. Par conséquent, il y a un besoin immédiat d’une méthode de contrôle de la qualité évaluer les qualités de la cellule à la transplantation. Ici, nous fournissons des protocoles étape par étape pour l’évaluation de l’intégrité de l’ADN des cellules souches avant la transplantation de cellules.

Introduction

Les preuves expérimentales et cliniques montrent que les cellules hématopoïétiques peut améliorer modérément la performance contractile du ventricule gauche n’a pas de coeurs1,2,3,4,5 ,6,7,8,9. Les progrès récents ont ouvert davantage attrayant de possibilités pour la regénération cardiovasculaire ; citons l’expression forcée des facteurs de reprogrammation de cellules somatiques pour induire la pluripotence et différencier ces des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) en différentes lignées cardiaques, ce qui est important cardiomyocyte (CM)10, 11 , 12 , 13. le matériel héréditaire dans chaque cellule, y compris le CISP artificiellement généré et dérivés iPSC CM (iPS-CM), est l’ADN. Les instructions génétiques stockées dans ADN dicte la croissance, le développement et la fonction des cellules, tissus, organes et organismes. L’ADN n’est pas inerte ; métabolites, comme réactives de l’oxygène carbonyle et azotés, de cellules et des agents alkylants ADN cause endommager in vitro et in vivo14,15,16,17. Ce qui est important, les dommages à l’ADN se produisent intuitivement dans chaque cellule, avec une fréquence significative. Si ces dommages ne sont pas corrigées, il conduira à la mutation de l’ADN, la sénescence cellulaire, la perte d’intégrité de l’ADN et de cellules et éventuellement, des maladies, y compris les cancers mortels. Conserver l’intégrité de l’ADN est donc essentielle pour n’importe quelle cellule, en particulier la CISP, qui a un potentiel énorme dans la clinique.

Pour évaluer la quantité et l’intégrité de l’ADN génomique isolé, un matériel onéreux est disponible sur le marché. Cependant, il n’y a aucune méthode simple et économique pour évaluer l’intégrité de l’ADN dans les cellules sans isoler les cellules. En outre, dégradation de l’ADN induite par l’utilisateur lors de l’isolation de l’ADN est l’un des inconvénients majeurs dans l’utilisation de ces méthodes. Les unicellulaires gel électrophorèse (connu comme le test des comètes)18,19 et γH2A.X immunomarquage8 techniques sont des approches fondamentales dans les laboratoires de recherche pour évaluer les dommages à l’ADN. Ces deux méthodes ne nécessitent pas de matériel coûteux ou ADN génomique isolé pour analyser l’ADN intégrité8,20,21. Depuis, ces techniques ont été réalisées avec des cellules entières ; dégradation de l’ADN/ARN/protéines induite par l’utilisateur lors de la préparation de l’échantillon n’affectera pas ces protocoles. Ici, pour évaluer les dommages à l’ADN et la réponse aux dommages de l’ADN dans les souches et les cellules de tige-cellule-dérivé, nous fournissons des protocoles étape par étape pour effectuer les deux la comète dosage et γH2A.X immunomarquage. En outre, combinant ces deux approches, nous vous proposons une évaluation naïve qui peut être utilisée pour évaluer les qualités de la cellule à la transplantation.

Le test des comètes ou unicellulaires électrophorèse sur gel, mesure les cassures de l’ADN dans les cellules. Incorporé dans l’agarose à bas point de fusion des cellules sont lysées à nucléoïdes formulaire contenant de l’ADN surenroulé. Lors de l’électrophorèse, petits morceaux de fragments d’ADN et des brins d’ADN cassés migre à travers les pores du gel d’agarose, alors que l’ADN intact, en raison de leur taille énorme et leur conjugaison avec la protéine de la matrice, aura une migration restreinte. Le modèle de l’ADN tachée sous un microscope à fluorescence imite une comète. La tête de la comète contient l’ADN intact et la queue est composée de fragments et cassée brins d’ADN. La fraction des dommages à l’ADN peut être mesurée par l’intensité de la fluorescence de l’ADN endommagé (queue de comète) par rapport à l’intensité de (tête de la comète) ADN intacte. Le moment de queue de paramètre peut être calculé comme indiqué à la Figure 1.

Dommages à l’ADN induit la phosphorylation de l’histone H2A. X (γH2A.X) sur le Ser139 par les kinases ATM, ATR et ADN-PK. La phosphorylation et le recrutement de H2A. X à ruptures de brins d’ADN est appelée réponse aux dommages de l’ADN (DDR) et arrive rapidement après que l’ADN est endommagé. Suite à ce processus, l’arrestation d’induite par le point de contrôle de cycle de cellules et l’ADN, processus de réparation sont initiées. Après l’achèvement de la réparation de l’ADN, γH2A.X est déphosphorylée et inactivé par les phosphatases. Prolongée et plusieurs brins d’ADN conduisent à l’accumulation de foyers γH2A.X dans l’ADN. Cela indique l’incapacité de la cellule pour réparer les lésions de l’ADN et la perte d’intégrité de l’ADN. Ces foyers γH2A.X dans l’ADN peuvent être identifiés par et le nombre de foyers DDR peut être compté en utilisant le protocole à l’article 2.

Protocol

1. essai de comet Préparation du réactif D’agarose de la bas-fondre-point, lieu 500 mg de bas point de fusion d’agarose dans 100 mL d’ADN- / eau exempte de RNA. Faire chauffer la bouteille dans un four à micro-ondes jusqu’à ce que l’agarose se dissout. Placer la bouteille dans un bain d’eau de 37 ° C jusqu’à ce que nécessaire.Remarque : Pour en savoir plus, voir Azqueta et al., qui a étudié les effets de la concentration d’agarose sur le tem…

Representative Results

Cellules souches humaines pluripotentes induites ont été cultivés, et les dommages à l’ADN et le moment de la queue, qui ont été utilisés comme mesure d’intégrité de l’ADN, ont été analysées par le test des comètes. CSPI ont été intégrés dans l’agarose de la bas-fondre-point et placé sur une lame de verre. Les cellules ont, ensuite, traitées avec tampon de lyse, suivie par une solution alcaline, à obtenir l’ADN surenroulé. Nucléoïdes étaient grande et com…

Discussion

Intégrité de l’ADN dépeint l’intégrité cellulaire. Cellules avec ADN endommagé sont souvent stress et finissent par perdent leur intégrité. L’intégrité des souches et de cellules de tige-cellule-dérivé étant propagés aux fins de transplantation est principale pour les cellules de remplir leur fonction désirée. La transplantation de cellules avec de l’ADN endommagé se traduirait par un taux de mauvaise prise de greffe et de la performance de la cellule8,<sup clas…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu en partie par le National Heart, Lung, and Blood Institute subventions RO1-HL-99507, HL-114120, HL-131017, HL138023 et UO1-HL-134764 (à J. Zhang) et par l’American Heart Association scientifique Development Grant 17SDG33670677 (de Gigi R.).

Materials

0.25% Trypsin Corning 25200056
8-well chamber slide Millicell PEZGS0816
Accutase Stemcell Technologies 7920 Cell detachment solution
Alexa Fluor 488 AffiniPure
Donkey Anti-Rabbit IgG
Jackson Immuno
Research Laboratories
711-545-152
(RRID: AB_2313584)
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson Immuno
Research Laboratories
711-165-152
(RRID:AB_2307443)
DAPI Sigma-Aldrich D9564
Gibco B-27 Supplement, Serum Free, Gibco 17504-044
Matrigel growth factor reduced Corning 354230
mTeSR1 Stemcell Technologies 85850
PhalloidinA488 Life Technology A12379
Phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody Cell Signaling Technology 2577 (RRID: AB_2118010)
RPMI Gibco 11875-093
SYBR Green I nucleic acid gel stain Sigma-Aldrich S9430
Triton X-100 Fisher scientific BP151-100
UltraPure Low melting Point Agarose Invitrogen 16520050
Vectashield Vector Laboratories H-1000 Antifade

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Miller, J. M., Mardhekar, N. M., Rajasekaran, V., Zhang, J., Kannappan, R. Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy. J. Vis. Exp. (143), e58971, doi:10.3791/58971 (2019).

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