कार्डियक सेल थेरेपी के लिए स्टेम सेल डीएनए अखंडता का आकलन
Summary
यहां, हम स्टेम सेल में डीएनए अखंडता के आकलन के एक विश्लेषण के लिए एक प्रयोगात्मक सेटअप के एक विस्तृत विवरण प्रदान करने से पहले कोशिका प्रत्यारोपण ।
Abstract
स्टेम और स्टेम सेल-व्युत्पन्न कोशिकाओं को विभिन्न अपक्षयी रोगों के लिए एक पुनः अपक्षय चिकित्सा के रूप में अपार क्षमता है । डीएनए, स्टेम सेल सहित सभी कोशिकाओं में आनुवंशिक डेटा की गोदाम है, और इसकी अखंडता अपनी अपक्षयी क्षमता के लिए मौलिक है । स्टेम सेल प्रयोगशालाओं में तेजी से प्रसार के लिए प्रत्यारोपण के लिए आवश्यक संख्या को प्राप्त करने के लिए गुजरना । त्वरित कोशिका वृद्धि संचित चयापचयों, जैसे प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन, carbonyl, और alkylating एजेंटों द्वारा डीएनए अखंडता की हानि की ओर जाता है । इन कोशिकाओं के प्रत्यारोपण गरीब engraftment और बिगड़ती अंग के उत्थान में परिणाम होगा । इसके अलावा, डीएनए प्रत्यारोपण क्षतिग्रस्त कोशिकाओं उत्परिवर्तनों की ओर जाता है, डीएनए अस्थिरता, सेलुलर वार्धक्य, और संभवतः, जीवन की धमकी रोगों जैसे कैंसर । इसलिए, प्रत्यारोपण के लिए सेल की उपयुक्तता का मूल्यांकन करने के लिए एक गुणवत्ता नियंत्रण विधि के लिए एक तत्काल की जरूरत है । यहां, हम कोशिका प्रत्यारोपण से पहले स्टेम सेल के डीएनए अखंडता के आकलन के लिए कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं ।
Introduction
प्रयोगात्मक और नैदानिक सबूत दर्शाता है कि कोशिका प्रत्यारोपण मामूली असफल दिल1,2,3,4,5 के वाम निलय सिकुड़ा प्रदर्शन में सुधार कर सकते हैं ,6,7,8,9. हाल के अग्रिमों हृदय पुनर्जनन के लिए आगे अपील के अवसर खुल गए हैं; ये दैहिक कोशिकाओं में reprogramminging कारकों की मजबूर अभिव्यक्ति के लिए pluripotency प्रेरित और इन प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं अलग कार्डियक वंश में (iPSC) अंतर शामिल हैं, महत्वपूर्ण बात cardiomyocyte (मुख्यमंत्री)10, 11 , 12 , 13. हर कोशिका में वंशानुगत सामग्री, जिसमें कृत्रिम रूप से सृजित iPSCs और iPSC-व्युत्पन्न मुख्यमंत्री (आईपीएस-cm) शामिल हैं, डीएनए है । डीएनए में संग्रहित आनुवंशिक निर्देश वृद्धि, विकास, और कोशिकाओं, ऊतकों, अंगों, और जीवों के समारोह हुक्म । डीएनए निष्क्रिय नहीं है; सेल चयापचयों, जैसे प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन, carbonyl, और नाइट्रोजन प्रजातियों, और alkylating एजेंटों डीएनए नुकसान इन विट्रो में और vivo14,15,16,17में पैदा कर सकता है । महत्वपूर्ण बात, डीएनए क्षति हर कोशिका में सहज रूप से होता है, एक महत्वपूर्ण आवृत्ति के साथ. इन नुकसानों को सही नहीं कर रहे हैं, यह डीएनए उत्परिवर्तन, सेलुलर वार्धक्य, डीएनए और सेल अखंडता की हानि, और संभवतः, जीवन धमकी कैंसर सहित रोगों, के लिए नेतृत्व करेंगे । इसलिए, डीएनए अखंडता को बनाए रखने के किसी भी कोशिका के लिए आवश्यक है, विशेष रूप से iPSCs, कि क्लिनिक में भारी क्षमता है ।
मात्रा और अलग जीनोमिक डीएनए की अखंडता का आकलन करने के लिए, महंगे उपकरण बाजार पर उपलब्ध है । हालांकि, कोशिकाओं को अलग करने के बिना कोशिकाओं में डीएनए अखंडता का आकलन करने के लिए कोई सरल और लागत प्रभावी तरीके हैं । इसके अलावा, डीएनए अलगाव के दौरान उपयोगकर्ता प्रेरित डीएनए क्षरण इन तरीकों का उपयोग करने में प्रमुख खामियों में से एक है । एकल सेल जेल ट्रो (धूमकेतु परख के रूप में जाना जाता है)18,19 और γH2A. X immunolabeling8 तकनीक डीएनए क्षति का आकलन करने के लिए अनुसंधान प्रयोगशालाओं में मौलिक दृष्टिकोण हैं । इन दो तरीकों महंगा उपकरण या पृथक जीनोमिक डीएनए डीएनए अखंडता8,20,21का विश्लेषण करने की आवश्यकता नहीं है । के बाद से, इन तकनीकों पूरे कोशिकाओं के साथ प्रदर्शन किया गया है; उपयोगकर्ता प्रेरित डीएनए/आरएनए/नमूना तैयारी के दौरान प्रोटीन क्षरण इन प्रोटोकॉल को प्रभावित नहीं करेगा । यहां, डीएनए क्षति और स्टेम में डीएनए क्षति की प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए सेल व्युत्पंन कोशिकाओं, हम कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रदान करने के लिए दोनों धूमकेतु परख और γH2A. X immunolabeling प्रदर्शन करते हैं । इसके अलावा, इन दो तरीकों के संयोजन, हम एक भोली आकलन है कि प्रत्यारोपण के लिए सेल की उपयुक्तता का मूल्यांकन किया जा सकता है का प्रस्ताव ।
धूमकेतु परख, या एकल सेल जेल ट्रो, कोशिकाओं में डीएनए टूटता उपाय । कम पिघलने agarose में एंबेडेड कोशिकाओं supercoiled डीएनए युक्त nucleoids फार्म करने के लिए लीजड ड हैं । ट्रो पर, खंडित डीएनए के छोटे टुकड़े और टूट डीएनए किस्में agarose pores के माध्यम से विस्थापित, जबकि बरकरार डीएनए, उनके विशाल आकार और मैट्रिक्स प्रोटीन के साथ उनके विकार के कारण, एक सीमित प्रवास होगा । एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत सना हुआ डीएनए का पैटर्न एक धूमकेतु की नकल । धूमकेतु सिर बरकरार डीएनए है और पूंछ टुकड़े और टूटे डीएनए किस्में से बना है । डीएनए क्षति के अंश क्षतिग्रस्त डीएनए (धूमकेतु पूंछ) के सापेक्ष बरकरार डीएनए (धूमकेतु सिर) की तीव्रता के प्रतिदीप्ति तीव्रता से मापा जा सकता है. पैरामीटर पूंछ पल चित्रा 1में दिखाया गया के रूप में गणना की जा सकती है ।
डीएनए क्षति हिस्टोन H2A के फास्फारिलीकरण लाती है । एटीएम, एटीआर, और डीएनए-पीके kinases द्वारा Ser139 पर एक्स (γH2A. x) । फास्फारिलीकरण और H2A की भर्ती । डीएनए किनारा टूटता में एक्स डीएनए क्षति प्रतिक्रिया (DDR) कहा जाता है और डीएनए क्षतिग्रस्त होने के बाद तेजी से होता है । इस प्रक्रिया के बाद, चौकी-मध्यस्थता सेल चक्र गिरफ्तारी और डीएनए मरंमत प्रक्रियाओं शुरू कर रहे हैं । डीएनए की मरंमत के सफल समापन के बाद, γH2A. X dephosphorylated और phosphatases द्वारा निष्क्रिय है । लंबे समय तक और कई डीएनए किनारा टूट जाता है डीएनए में γH2A. X घावों के संचय के लिए सीसा । इससे डीएनए की क्षति और डीएनए अखंडता की क्षति की मरम्मत करने में कोशिका की अक्षमता का संकेत मिलता है । डीएनए में इन γH2A. X घावों की पहचान की जा सकती है और DDR घावों की संख्या खंड 2 में प्रोटोकॉल का उपयोग करके गिना जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
डीएनए अखंडता कोशिका अखंडता चित्रित । क्षतिग्रस्त डीएनए के साथ कोशिकाओं को अक्सर तनाव में है और अंततः अपनी अखंडता खो देते हैं । स्टेम और स्टेम सेल व्युत्पंन कोशिकाओं है कि प्रत्यारोपण के प्रयोजन के लि?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम राष्ट्रीय हार्ट, फेफड़े, और रक्त संस्थान अनुदान RO1-एचएल-९९५०७, एचएल-११४१२०, एचएल-१३१०१७, HL138023, और UO1-एचएल-१३४७६४ (जे जांग के लिए) और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन वैज्ञानिक विकास अनुदान 17SDG33670677 (आर Kannappan) द्वारा भाग में समर्थित किया गया था ।
Materials
| 0.25% Trypsin | Corning | 25200056 | |
| 8-well chamber slide | Millicell | PEZGS0816 | |
| Accutase | Stemcell Technologies | 7920 | Cell detachment solution |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG |
Jackson Immuno Research Laboratories |
711-545-152 (RRID: AB_2313584) |
|
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson Immuno Research Laboratories |
711-165-152 (RRID:AB_2307443) |
|
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9564 | |
| Gibco B-27 Supplement, Serum Free, | Gibco | 17504-044 | |
| Matrigel growth factor reduced | Corning | 354230 | |
| mTeSR1 | Stemcell Technologies | 85850 | |
| PhalloidinA488 | Life Technology | A12379 | |
| Phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody | Cell Signaling Technology | 2577 (RRID: AB_2118010) | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| SYBR Green I nucleic acid gel stain | Sigma-Aldrich | S9430 | |
| Triton X-100 | Fisher scientific | BP151-100 | |
| UltraPure Low melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Antifade |
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