Vurdere Stem Cell DNA integritet for Cardiac cellen terapi
Summary
Her gir vi en detaljert beskrivelse av en eksperimentelle oppsett for en analyse av vurdering av DNA integritet i stamceller før cellen transplantasjon.
Abstract
Stilk og stem-cell-derived celler har enorme potensial som en regenererende terapi for ulike degenerative sykdommer. DNA er Stabburet genetisk data i alle celler, inkludert stamceller, integriteten er grunnleggende for regenerativ evnen. Stamceller gjennomgår rask overføring i laboratorier for å oppnå de nødvendige numrene for transplantasjon. Akselerert cellevekst fører til tap av DNA integritet av akkumulert metabolitter, som reaktive oksygen, karbonyl og alkylating agenter. Transplantere disse cellene vil resultere i fattig engraftment og fornyelse av den forverrede orgelet. Videre transplanting DNA-skadet cellene fører til mutasjoner, DNA ustabilitet, mobilnettet senescence, og muligens livstruende sykdommer som kreft. Derfor er det et umiddelbart behov for en kvalitetskontroll-metoden for å evaluere cellens egnethet for transplantasjon. Her gir vi trinnvise protokoller for vurdering av DNA integritet stamceller før cellen transplantasjon.
Introduction
Experimental og klinisk bevis viser at cellen transplantasjon moderat kan forbedre venstre ventrikkel kontraktile ytelsen av sviktende hjerter1,2,3,4,5 ,6,7,8,9. Nylige fremskritt har åpnet tiltalende ytterligere muligheter for hjerte gjenfødelse; Disse inkluderer tvunget uttrykket omprogrammering faktorer i somatiske celler å indusere pluripotency og skille disse indusert pluripotent stamceller (iPSC) i ulike cardiac linjene, viktigere cardiomyocyte (CM)10, 11 , 12 , 13. arvelige materialet i hver celle, inkludert kunstig generert iPSCs og iPSC-avledet CM (iPS-CM), er DNA. Den genetiske instruksjoner lagret i DNA dikterer vekst, utvikling og funksjon av celler, vev, organer og organismer. DNA er ikke inert; celle metabolitter, som reaktive oksygen, karbonyl og nitrogen arter, og alkylating agenter kan forårsake DNA skade i vitro og in vivo14,15,16,17. Viktigere, oppstår DNA skade intuitivt i hver celle, med en betydelig frekvens. Hvis disse skader ikke korrigeres, vil det føre til DNA mutasjon, mobilnettet senescence, tap av DNA og celle integritet og muligens sykdommer, inkludert livstruende kreft. Derfor er beholder DNA integritet avgjørende for en celle, spesielt iPSCs, som har et enormt potensial i klinikken.
For vurdering av antall og isolert genomisk DNA, er dyrt utstyr tilgjengelig på markedet. Det er imidlertid ingen enkel og kostnadseffektiv metoder å vurdere DNA integritet i celler uten å isolere cellene. Videre er bruker-indusert DNA fornedrelse under DNA isolasjon en av de største ulempene ved disse metodene. Encellede gel geleelektroforese (kjent som kometen analysen)18,19 og γH2A.X immunolabeling8 teknikkene er grunnleggende metoder i laboratorier for å vurdere DNA skade. Disse to metodene krever ikke dyrt utstyr eller isolert genomisk DNA å analysere DNA integritet8,20,21. Siden er disse teknikkene utført med hele celler. bruker-indusert DNA/RNA/protein fornedrelse under eksempel utarbeidelsen påvirker ikke disse protokollene. Her, for å vurdere DNA skade og DNA skade respons i stammen og stem-cell-derived celler, gir vi trinnvise protokoller for å utføre både comet analysen og γH2A.X immunolabeling. Videre foreslår vi kombinere disse to tilnærmingene, en naiv vurdering som kan brukes til å evaluere cellens egnethet for transplantasjon.
Comet analysen, eller encellede gel geleelektroforese, måler DNA pauser i celler. Celler i lav-smeltende agarose er lysed til skjemaet nucleoids som inneholder supercoiled DNA. På geleelektroforese vandrer små biter av fragmentert DNA og brutt DNA tilnærmingene gjennom agarose porene, mens intakt DNA, sine enorme og deres Bøyning med matrix protein, vil ha en begrenset overføring. Mønsteret av farget DNA under fluorescens mikroskop etterligner en komet. Comet hodet inneholder intakt DNA og halen er består av fragmenter og brutt DNA tilnærmingene. Brøkdel av DNA skade kan måles ved fluorescens intensiteten av skadet DNA (kometen hale) i forhold til intakt DNA (comet leder) intensiteten. Parameteren hale øyeblikket kan beregnes som vist i figur 1.
DNA skade induserer fosforylering av histone H2A. X (γH2A.X) på Ser139 av ATM, ATR og DNA-PK kinaser. Den fosforylering og rekruttering av H2A. X på DNA strand bryter kalles DNA skade svar (DDR) og skjer raskt etter DNA er skadet. Etter denne prosessen, checkpoint-mediert celle syklus arrestasjon og DNA reparasjon prosesser er igangsatt. Etter en vellykket gjennomføring av DNA-reparasjon, er γH2A.X dephosphorylated inaktivert av phosphatases Langvarig og flere DNA strand bryter føre til opphopning av γH2A.X foci i DNA. Dette angir cellens manglende evne til å reparere DNA-skader og tap av DNA integritet. Disse γH2A.X foci i DNA kan identifiseres ved og antall DDR foci kan telles ved hjelp av protokollen i § 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA integritet skildrer celle integritet. Celler med skadet DNA er ofte i stress, og til slutt mister sin integritet. Integriteten til stammen og stem-cell-derived celler som blir propagated å transplantasjon er rektor for cellene å utføre ønsket arbeidet. Transplanting celler med skadet DNA vil resultere i en dårlig engraftment hastighet og ytelse av cellen8,20. Derfor er undersøke DNA integritet før cellen transplantasjon en nødvendig kvalitet kontrollp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet var støttes delvis av nasjonale hjerte, lunge og blod Institute tilskudd RO1-HL-99507, HL-114120, HL-131017, HL138023 og UO1-HL-134764 (å J. Zhang) og American Heart Association vitenskapelige Development Grant 17SDG33670677 (til R. Kannappan).
Materials
| 0.25% Trypsin | Corning | 25200056 | |
| 8-well chamber slide | Millicell | PEZGS0816 | |
| Accutase | Stemcell Technologies | 7920 | Cell detachment solution |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG |
Jackson Immuno Research Laboratories |
711-545-152 (RRID: AB_2313584) |
|
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson Immuno Research Laboratories |
711-165-152 (RRID:AB_2307443) |
|
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9564 | |
| Gibco B-27 Supplement, Serum Free, | Gibco | 17504-044 | |
| Matrigel growth factor reduced | Corning | 354230 | |
| mTeSR1 | Stemcell Technologies | 85850 | |
| PhalloidinA488 | Life Technology | A12379 | |
| Phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody | Cell Signaling Technology | 2577 (RRID: AB_2118010) | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| SYBR Green I nucleic acid gel stain | Sigma-Aldrich | S9430 | |
| Triton X-100 | Fisher scientific | BP151-100 | |
| UltraPure Low melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Antifade |
References
- Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. The Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
- Makkar, R. R., et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. The Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).
- Tomita, Y., et al. Cardiac neural crest cells contribute to the dormant multipotent stem cell in the mammalian heart. Journal of Cell Biology. 170 (7), 1135-1146 (2005).
- Oyama, T., et al. Cardiac side population cells have a potential to migrate and differentiate into cardiomyocytes in vitro and in vivo. Journal of Cell Biology. 176 (3), 329-341 (2007).
- Fischer, K. M., et al. Enhancement of myocardial regeneration through genetic engineering of cardiac progenitor cells expressing Pim-1 kinase. Circulation. 120 (21), 2077-2087 (2009).
- Cottage, C. T., et al. Cardiac progenitor cell cycling stimulated by pim-1 kinase. Circulation Research. 106 (5), 891-901 (2010).
- Angert, D., et al. Repair of the injured adult heart involves new myocytes potentially derived from resident cardiac stem cells. Circulation Research. 108 (10), 1226-1237 (2011).
- Kannappan, R., et al. p53 Modulates the Fate of Cardiac Progenitor Cells Ex vivo and in the Diabetic Heart In vivo. EBioMedicine. 16, 224-237 (2017).
- Hatzistergos, K. E., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells stimulate cardiac stem cell proliferation and differentiation. Circulation Research. 107 (7), 913-922 (2010).
- Okita, K., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: opportunities and challenges. Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1575), 2198-2207 (2011).
- Zhang, J., et al. Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).
- Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
- Zhang, L., et al. Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast. Circulation: Heart Failure. 8 (1), 156-166 (2015).
- Hirakawa, K., Midorikawa, K., Oikawa, S., Kawanishi, S. Carcinogenic semicarbazide induces sequence-specific DNA damage through the generation of reactive oxygen species and the derived organic radicals. Mutation Research. 536 (1-2), 91-101 (2003).
- Martinez, G. R., et al. Oxidative and alkylating damage in DNA. Mutation Research. 544 (2-3), 115-127 (2003).
- Valko, M., Rhodes, C. J., Moncol, J., Izakovic, M., Mazur, M. Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer. Chemico-Biological Interactions. 160 (1), 1-40 (2006).
- Wiseman, H., Halliwell, B. Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer. Biochemical Journal. 313 (Pt 1), 17-29 (1996).
- Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 123 (1), 291-298 (1984).
- Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Experimental Cell Research. 175 (1), 184-191 (1988).
- Goichberg, P., et al. Age-associated defects in EphA2 signaling impair the migration of human cardiac progenitor cells. Circulation. 128 (20), 2211-2223 (2013).
- Kannappan, R., Mattapally, S., Wagle, P. A., Zhang, J. Transactivation domain of p53 regulates DNA repair and integrity in human iPS cells. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. , (2018).
- Al-Baker, E. A., Oshin, M., Hutchison, C. J., Kill, I. R. Analysis of UV-induced damage and repair in young and senescent human dermal fibroblasts using the comet assay. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (6-7), 664-672 (2005).
- Azqueta, A., Gutzkow, K. B., Brunborg, G., Collins, A. R. Towards a more reliable comet assay: optimising agarose concentration, unwinding time and electrophoresis conditions. Mutation Research. 724 (1-2), 41-45 (2011).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), R100 (2006).
- Paradis, A. N., Gay, M. S., Zhang, L. Binucleation of cardiomyocytes: the transition from a proliferative to a terminally differentiated state. Drug Discovery Today. 19 (5), 602-609 (2014).
