Bedömningen av Stem Cell DNA integritet för hjärt cellterapi
Summary
Här, ger vi en detaljerad beskrivning av ett experiment för en analys av bedömning av DNA integritet i stamceller före stamcellstransplantation.
Abstract
Stammen och stem-cell-derived celler har enorm potential som en regenerativ terapi för olika degenerativa sjukdomar. DNA är förrådshuset av genetiska data i alla celler, inklusive stamceller, och dess integritet är grundläggande för dess regenerativ förmåga. Stamceller genomgå forförökningen i labb att uppnå den nödvändiga nummer för transplantation. Accelererad celltillväxt leder till förlust av DNA integritet av ackumulerade metaboliter, såsom reaktiva syre, karbonyl och alkylerande medel. Transplantera dessa celler skulle resultera i dålig engraftment och regenerering av försämrade orgeln. Dessutom omplantering DNA-skadade celler leder till mutationer, DNA instabilitet, cellulära åldras, och möjligen livshotande sjukdomar som cancer. Därför finns det ett omedelbart behov av en kvalitetskontroll metod att bedöma cellens lämplighet för transplantation. Här, tillhandahåller vi stegvisa protokoll för bedömning av DNA integritet stamceller före stamcellstransplantation.
Introduction
Experimentella och kliniska bevis visar att stamcellstransplantation kan måttligt förbättra vänster kammare kontraktila misslyckas hjärtan1,2,3,4,5 ,6,7,8,9. Senaste framstegen har öppnat ytterligare tilltalande möjligheter för kardiovaskulär föryngring. Dessa omfattar uttrycket påtvingad omplanering faktorer i kroppsceller att inducera pluripotency och differentiera dessa inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) i olika hjärt härstamningar, huvudsakligen hjärtmuskelcellen (CM)10, 11 , 12 , 13. de ärftligt materiellt i varje cell, inklusive artificiellt genererade iPSCs och iPSC-derived CM (iPS-CM), är DNA. De genetiska instruktioner lagras i DNA dikterar tillväxt, utveckling och funktion av celler, vävnader, organ och organismer. DNA är inte inert; cell metaboliter, såsom reaktiva syre, karbonyl och kväve arter, och alkylerande medel kan orsaka DNA skada in vitro- och in vivo14,15,16,17. Ännu viktigare, uppstår DNA-skador intuitivt i varje cell, med en betydande frekvens. Om dessa skador inte åtgärdas kommer det leda till DNA mutation, cellulära åldras, förlusten av DNA och cell integritet, och eventuellt sjukdomar, inklusive livshotande cancerformer. Därför är behåller DNA integritet viktigt till en cell, särskilt iPSCs, som har en enorm potential i kliniken.
För att bedöma kvantitet och integritet isolerat genomiskt DNA, finns dyra utrustning tillgänglig på marknaden. Men finns det inga enkla och kostnadseffektiva metoder för att bedöma integriteten DNA i cellerna utan att isolera cellerna. Dessutom är användare-inducerad DNA nedbrytning under DNA isolering en av de stora nackdelarna med att använda dessa metoder. Encelliga gelelektrofores (känd som komet assay)18,19 och γH2A.X immunolabeling8 tekniker är grundläggande synsätt i forskningslaboratorier för bedömning av DNA-skador. Dessa två metoder kräver inte dyr utrustning eller isolerat genomiskt DNA att analysera DNA integritet8,20,21. Eftersom har dessa tekniker utförts med hela celler; användaren-inducerad DNA/RNA/protein nedbrytning under provberedningen kommer inte att påverka dessa protokoll. Här, för att bedöma DNA-skada och DNA skada svar i stammen och stem-cell-derived celler, tillhandahåller vi stegvisa protokoll för att utföra båda komet assay och γH2A.X immunolabeling. Dessutom föreslår vi att kombinera dessa två strategier, en naiv bedömning som kan användas för att bedöma cellens lämplighet för transplantation.
Det komet assay eller encelliga gel elektrofores, åtgärder DNA raster i celler. Celler inbäddade i låg-smältande agaros är lyserat till formuläret nucleoids innehållande supercoiled DNA. Vid elektrofores migrera små bitar av fragmenterade DNA och trasiga DNA-strängar genom agarosgelelektrofores porerna, medan intakta DNA, på grund av sin enorma storlek och deras konjugering med proteinet matrix, kommer att ha en begränsad invandring. Mönstret av färgade DNA i fluorescens Mikroskop härmar en komet. Komet huvudet innehåller intakta DNA och svansen är består av fragment och trasiga DNA-strängar. Fraktionen av DNA-skador kan mätas genom fluorescensintensiteten hos skadade DNA (komet svans) relativt intakta DNA (komet huvud) intensiteten. Parametern svans nu kan beräknas som visas i figur 1.
DNA-skada inducerar fosforyleringen av Histon H2A. X (γH2A.X) på Ser139 av ATM, ATR och DNA-PK kinaser. Fosforylering och rekrytering av H2A. X vid DNA strand raster kallas DNA skador svar (DDR) och händer snabbt efter DNA är skadad. Efter denna process, checkpoint-medierad cellcykelarrest och DNA reparationsprocesser initieras. Efter det framgångsrika slutförandet av DNA-reparation, är γH2A.X defosforyleras och inaktiverat av fosfataser. Långvarig och flera DNA strand raster leda till ansamling av γH2A.X foci i DNA. Detta anger cellens oförmåga att reparera DNA-skador och förlust av DNA integritet. Dessa γH2A.X foci i DNA kan identifieras genom och antalet DDR foci kan räknas med protokollet i avsnitt 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA integritet porträtterar cellernas integritet. Celler med skadat DNA är ofta stress och så småningom förlorar sin integritet. Stamceller och stamceller-cell-derived celler som sprids i syfte att transplantation integritet är rektor för cellerna att utföra deras önskad funktion. Transplantation av celler med skadat DNA skulle resultera i en dålig engraftment hastighet och prestanda av cell8,20. Att undersöka DNA integritet före stamcellstransplantat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete var stöds delvis av nationella hjärta, lungor och blod Institute bidrag RO1-HL-99507, HL-114120, HL-131017, HL138023 och UO1-HL-134764 (till J. Zhang) och av amerikanska hjärtat Association vetenskapliga utveckling Grant 17SDG33670677 (till R. Gitta).
Materials
| 0.25% Trypsin | Corning | 25200056 | |
| 8-well chamber slide | Millicell | PEZGS0816 | |
| Accutase | Stemcell Technologies | 7920 | Cell detachment solution |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG |
Jackson Immuno Research Laboratories |
711-545-152 (RRID: AB_2313584) |
|
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson Immuno Research Laboratories |
711-165-152 (RRID:AB_2307443) |
|
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9564 | |
| Gibco B-27 Supplement, Serum Free, | Gibco | 17504-044 | |
| Matrigel growth factor reduced | Corning | 354230 | |
| mTeSR1 | Stemcell Technologies | 85850 | |
| PhalloidinA488 | Life Technology | A12379 | |
| Phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody | Cell Signaling Technology | 2577 (RRID: AB_2118010) | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| SYBR Green I nucleic acid gel stain | Sigma-Aldrich | S9430 | |
| Triton X-100 | Fisher scientific | BP151-100 | |
| UltraPure Low melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Antifade |
References
- Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. The Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
- Makkar, R. R., et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. The Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).
- Tomita, Y., et al. Cardiac neural crest cells contribute to the dormant multipotent stem cell in the mammalian heart. Journal of Cell Biology. 170 (7), 1135-1146 (2005).
- Oyama, T., et al. Cardiac side population cells have a potential to migrate and differentiate into cardiomyocytes in vitro and in vivo. Journal of Cell Biology. 176 (3), 329-341 (2007).
- Fischer, K. M., et al. Enhancement of myocardial regeneration through genetic engineering of cardiac progenitor cells expressing Pim-1 kinase. Circulation. 120 (21), 2077-2087 (2009).
- Cottage, C. T., et al. Cardiac progenitor cell cycling stimulated by pim-1 kinase. Circulation Research. 106 (5), 891-901 (2010).
- Angert, D., et al. Repair of the injured adult heart involves new myocytes potentially derived from resident cardiac stem cells. Circulation Research. 108 (10), 1226-1237 (2011).
- Kannappan, R., et al. p53 Modulates the Fate of Cardiac Progenitor Cells Ex vivo and in the Diabetic Heart In vivo. EBioMedicine. 16, 224-237 (2017).
- Hatzistergos, K. E., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells stimulate cardiac stem cell proliferation and differentiation. Circulation Research. 107 (7), 913-922 (2010).
- Okita, K., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: opportunities and challenges. Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1575), 2198-2207 (2011).
- Zhang, J., et al. Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).
- Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
- Zhang, L., et al. Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast. Circulation: Heart Failure. 8 (1), 156-166 (2015).
- Hirakawa, K., Midorikawa, K., Oikawa, S., Kawanishi, S. Carcinogenic semicarbazide induces sequence-specific DNA damage through the generation of reactive oxygen species and the derived organic radicals. Mutation Research. 536 (1-2), 91-101 (2003).
- Martinez, G. R., et al. Oxidative and alkylating damage in DNA. Mutation Research. 544 (2-3), 115-127 (2003).
- Valko, M., Rhodes, C. J., Moncol, J., Izakovic, M., Mazur, M. Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer. Chemico-Biological Interactions. 160 (1), 1-40 (2006).
- Wiseman, H., Halliwell, B. Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer. Biochemical Journal. 313 (Pt 1), 17-29 (1996).
- Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 123 (1), 291-298 (1984).
- Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Experimental Cell Research. 175 (1), 184-191 (1988).
- Goichberg, P., et al. Age-associated defects in EphA2 signaling impair the migration of human cardiac progenitor cells. Circulation. 128 (20), 2211-2223 (2013).
- Kannappan, R., Mattapally, S., Wagle, P. A., Zhang, J. Transactivation domain of p53 regulates DNA repair and integrity in human iPS cells. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. , (2018).
- Al-Baker, E. A., Oshin, M., Hutchison, C. J., Kill, I. R. Analysis of UV-induced damage and repair in young and senescent human dermal fibroblasts using the comet assay. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (6-7), 664-672 (2005).
- Azqueta, A., Gutzkow, K. B., Brunborg, G., Collins, A. R. Towards a more reliable comet assay: optimising agarose concentration, unwinding time and electrophoresis conditions. Mutation Research. 724 (1-2), 41-45 (2011).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), R100 (2006).
- Paradis, A. N., Gay, M. S., Zhang, L. Binucleation of cardiomyocytes: the transition from a proliferative to a terminally differentiated state. Drug Discovery Today. 19 (5), 602-609 (2014).
