Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Kaiwen  Ivy Liu; Norfala-Aliah  Binte Sutrisnoh; Yuanming Wang; Meng How Tan

doi:10.3791/59086

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Genetics

CRISPR Cas を用いた哺乳類細胞におけるゲノム編集

Published: April 11, 2019

doi:

10.3791/59086

Kaiwen Ivy Liu, Norfala-Aliah Binte Sutrisnoh, Yuanming Wang², Meng How Tan²

¹Genome Institute of Singapore,Agency for Science Technology and Research, ²School of Chemical and Biomedical Engineering,Nanyang Technological University

Summary

CRISPR Cas は植物や動物の複雑なゲノムをエンジニアリングする強力な技術です。ここでは、我々は異なる Ca 酵素を使用して人間のゲノムを効率的に編集するためのプロトコルを詳しく説明します。我々は、重要な考慮事項と編集の効率を最適化する設計パラメーターを強調表示します。

Abstract

クラスター化された定期的に空間の短い回文繰り返し (CRISPR) システムは細菌の適応免疫の自然機能が、用途が正常に変更されて多くの異なる生物のゲノム工学のため。最も一般的に、または CRISPR 関連 9 (Cas9) または非相同末端結合 (NHEJ) 経路や相同性監督の修理 (を介して修理する DNA 二本鎖切断後、ゲノムの特定のサイトを切断するために使用 Cas12a エンドヌクレアーゼドナーのテンプレートがあるかによって HDR) 経路は、不在またはそれぞれ現在です。日には、哺乳類細胞でゲノムの編集を実行できるように細菌の異なる種から CRISPR システムを示されています。ただし、技術の見かけのシンプルさにもかかわらず複数の設計パラメーター必要があります考慮する頻繁のゲノム実験を編集を行う最高について当惑のユーザーを残して。ここでは、ゲノムを実験哺乳類セルラインでの編集が正常に実行を容易にする目的で、必要な DNA の変更を運ぶ細胞クローンの同定実験の設計から完全なワークフローを記述します。CRISPR システム、スペーサーの長さ、および単一座礁させた分野 (ssODN) ドナーテンプレートのデザインの選択など、メモを取るユーザーの重要な考慮事項を強調表示します。このワークフローは、遺伝子ノックアウト研究、疾患モデルの作業、役に立つでしょうか、記者の生成細胞を思い描いてください。

Introduction

すべての生きている有機体のゲノムをエンジニアリングすることで、病原の補正など、多くの医学・バイオテクノロジーアプリケーションの突然変異、病気の研究、正確な細胞モデルの構築や農業の生成望ましい特徴を持つ作物。世紀の変わり目以来は、哺乳類セルの meganucleases¹^,²^,³を含むゲノム工学の様々な技術が開発されて、亜鉛指の核酸の⁴^、⁵、または転写活性化因子のようなエフェクター核酸分解酵素 (TALENs)⁶^,⁷^,⁸^,⁹。ただし、これらの以前のテクノロジは、プログラムすることは困難または組み立て、退屈な研究と業界での普及を阻害します。

近年では、クラスター化された定期的に空間短い回文繰り返し (CRISPR) – CRISPR 関連 (Cas) システムは、強力な新しいゲノム工学技術¹⁰^,¹¹として浮上しています。もともと細菌の適応免疫系、それ正常にされている人間を含む動植物のゲノム育種のために展開します。なぜ CRISPR Cas は、このような短い時間でそんなに人気を得ている主な理由 Cas9 や Cas12a (Cpf1 とも呼ばれます) など、キー Cas エンドヌクレアーゼをもたらす要素は、ゲノム内の正しい場所は単にキメラシングルガイド RN の短い作品(SgRNA) を設計するは簡単で合成する安価であります。ターゲットサイトに採用されて後、Cas 酵素分子はさみのペアとして機能し、その RuvC、アレイ、または Nuc ドメイン¹²^,¹³^,¹⁴バインドされた DNA を切断します。結果として得られる二重鎖休憩 (DSB) 後で非相同末端結合 (NHEJ) または相同監督修理 (HDR) 経路を介して細胞によって修理されています。修理のテンプレートがない場合は、DSB のヌクレオチド (オクターリピート) カットのサイトでの擬似ランダム挿入または削除に上昇を与えることができます、エラーを起こしやすい NHEJ 経路による蛋白質のコーディングの遺伝子のフレームシフト変異を引き起こす可能性があります修理です。ただし、目的の DNA の変更を含むドナーテンプレートの存在下で、DSB は忠実度の高い HDR 経路によって修復します。ドナーテンプレートの一般的な種類には、一本鎖オリゴヌクレオチド (ssODNs) とプラスミドがあります。前者は、後者は通常使用されますが比較的長いシーケンスを挿入を希望する場合は、目的の DNA の変化が (たとえば、単一の基礎ペアの変化)、小さい場合に使われる (例えば、緑色蛍光蛋白質のコーディングシーケンスまたはGFP) ターゲット遺伝子座に。

Cas タンパク質の酵素活性には、ターゲットサイト¹⁵protospacer の隣接するモチーフ (PAM) の存在が必要です。Cas9 PAM、protospacer の 3′ 端に (Cpf1 とも呼ばれる) Cas12a PAM 5′ 端に代わりに¹⁶。Ca ガイド複雑な RNA は PAM¹⁷欠席がある場合、DSB を導入することができます。したがって、PAM は、特定の Ca ヌクレアーゼは切断することができるゲノムの位置に制約を配置します。幸いなことに、Cas 細菌種の核酸分解酵素は通常さまざまな PAM 要件を展示します。したがって、様々な CRISPR Cas システムを当社のエンジニアリングのツールボックスに統合することで、ゲノムの対象にできるサイトの範囲を展開できます。さらに、自然な Ca 酵素を設計またはさらにゲノムのターゲット操作¹⁸^,^,¹⁹²⁰にアクセスできる範囲を拡大、PAM のオルタナティブシーケンスを認識するように進化できます。

複数 CRISPR Cas システムはゲノムエンジニアリング目的で利用できるが、技術のほとんどのユーザーは、複数の理由主に化膿連鎖球菌(SpCas9) から Cas9 ヌクレアーゼに頼ってきました。まず、比較的単に NGG PAM、複雑 PAMs の存在下でのみ切断することができます他の多くの Ca のタンパク質とは異なりが必要です。第二に、ひと細胞²¹^,²²^,²³^,²⁴で展開することに最初の Ca エンドヌクレアーゼです。第三に、SpCas9 は日付に最高の特徴酵素を抜いて。研究者別の Ca ヌクレアーゼを使用する場合、彼または彼女しばしば不明瞭でしょう実験や SpCas9 と比較して異なる生物学的文脈で他の酵素がどのように実行される設計する最善の方法について。

異なる CRISPR Cas システムの相対的なパフォーマンスに明快さを提供するために我々は最近 5 Ca 酵素-SpCas9、黄色ブドウ球菌(SaCas9)、から Cas9 の酵素 Cas9 酵素の体系的な比較を実行しました。髄膜炎菌(NmCas9)、(AsCas12a)、 Acidaminococcus sp BV3L6 から Cas12a 酵素と菌Lachnospiraceae ND2006 から Cas12a 酵素 (LbCas12a)²⁵。公正な比較のためのターゲット・サイトと他の実験条件の同じセットを使用してさまざまな Cas 核酸を評価されます。技術のユーザーのための有用な参照として役立つであろう CRISPR Cas システムごとにも線引き研究設計パラメーター。ここより良い CRISPR Cas の活用研究を有効にするシステム、我々は別の Cas9 と Cas12a の酵素 (図 1参照) で最適なゲノム工学のステップバイステップのプロトコルを提供します。プロトコルにはだけでなく哺乳類細胞で成功したゲノムエンジニアリング結果の可能性を最大限にまた重要な設計上の考慮事項が、実験の詳細が含まれます。

図 1: ゲノムを生成するためのワークフローの概要がひと細胞ラインを編集します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Protocol

1. sgRNAs の設計適切な CRISPR Cas システムを選択します。まず、哺乳類細胞16, 21-32で機能することが示されているすべての Cas9 と Cas12a の核酸分解酵素の PAM シーケンスの対象地域を確認します。5 つの頻繁に使用される酵素は、一緒に彼らのそれぞれの PAMs表 1に与えられています。注: 酵素以外にも哺乳類セル同様、連鎖球菌サーモフィルス(St1Cas9) ?…

Representative Results

ゲノムの実験では、クローンを作成する必要があります興味の軌跡 sgRNA ターゲットを表現する CRISPR プラスミドを編集を実行します。最初に、プラスミッドはそれをリニア化する (通常型酵素) 制限の酵素と消化されます。完全および部分的な消化を区別する未消化プラスミドと一緒に 1% の agarose のゲルの消化の製品を解決することをお勧めします。未消化のプラスミドはスーパー、線形化?…

Discussion

CRISPR Cas システムは、エンジニアのゲノムおよびトランスクリプトームの植物や動物に強力な革新的な技術です。CRISPR Cas システムでは、ゲノム、トランスクリプトーム解析目的⁴⁴をエンジニアリングの適応が可能性があるを含む多くの菌種が見つかっています。化膿連鎖球菌(SpCas9) から Cas9 エンドヌクレアーゼが他の細菌由来の酵素細胞²¹^,<…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

M.H.T. は、科学技術と研究の共同協議会事務所の助成金 (1431AFG103) のための代理店でサポートされて、国立医療研究評議会は、(OFIRG/0017/2016) を付与、国立研究財団補助金 (046-NRF2013-THE001 ・ NRF2013-THE001-093)、教育層 1 の省許可 (RG50/17 (S))、スタートアップは、ナンヤン工科大学、南洋工科大学から国際遺伝子工学機械 (iGEM) 競争のための資金から付与します。

Materials

T4 Polynucleotide Kinase (PNK)	NEB	M0201
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)	NEB	M0371
Tris-Acetate-EDTA (TAE) Buffer, 50X	1st Base	BUF-3000-50X4L	Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 40 mM Tris, 20 mM acetic acid, and 1 mM EDTA.
Tris-EDTA (TE) Buffer, 10X	1st Base	BUF-3020-10X4L	Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 10 mM Tris (pH 8.0) and 1 mM EDTA.
BbsI	NEB	R0539
BsmBI	NEB	R0580
T4 DNA Ligase	NEB	M0202	400,000 units/ml
Quick Ligation Kit	NEB	M2200	An alternative to T4 DNA Ligase.
Rapid DNA Ligation Kit	Thermo Scientific	K1423	An alternative to T4 DNA Ligase.
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit	Thermo Scientific	451245	The salt solution comes with the TOPO vector in the kit.
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	NEB	E2621L	Kit for Gibson assembly.
One Shot Stbl3 Chemically Competent E.Coli	Thermo Scientific	C737303
LB Broth (Lennox), powder	Sigma Aldrich	L3022	Reconstitute in ddH₂0, and autoclave before use
LB Broth with Agar (Lennox), powder	Sigma Aldrich	L2897	Reconstitute in ddH₂0, and autoclave before use
SOC media	–	–	2.5 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 20 mM glucose in 1 L of LB Broth
Ampicillin (Sodium), USP Grade	Gold Biotechnology	A-301
REDiant 2X PCR Mastermix	1st Base	BIO-5185
Agarose	1st Base	BIO-1000
T7 Endonuclease I	NEB	M0302
Plasmid DNA Extraction Miniprep Kit	Favorgen	FAPDE 300
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose	Hyclone	SH30081.01	4.5 g/L Glucose, no L-glutamine, HEPES and Sodium Pyruvate
L-Glutamine, 200mM	Gibco	25030
Penicillin-Streptomycin, 10, 000U/mL	Gibco	15140
0.25% Trypsin-EDTA, 1X	Gibco	25200
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SV30160	FBS is heat inactivated before use at 56 ^oC for 30 min
Phosphate Buffered Saline, 1X	Gibco	20012
jetPRIME transfection reagent	Polyplus Transfection	114-75
QuickExtract DNA Extraction Solution, 1.0	Epicentre	LUCG-QE09050
ISOLATE II Genomic DNA Kit	Bioline	BIO-52067	An alternative to QuickExtract
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	M0491
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix	NEB	N0447
6X DNA Loading Dye	Thermo Scientific	R0611	10 mM Tris-HCl (pH 7.6) 0.03% bromophenol blue, 0.03% xylene cyanol FF, 60% glycerol, 60 mM EDTA
Protease Inhibitor Cocktail, Set3	Merck	539134
Nitrocellulose membrane, 0.2µm	Bio-Rad	1620112
Tris-glycine-SDS buffer, 10X	Bio-Rad	1610772	Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris, 192 mM glycine, and 0.1% SDS.
Tris-glycine buffer, 10X	1st base	BUF-2020	Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris and 192 mM glycine.
Ponceau S solution	Sigma Aldrich	P7170
TBS, 20X	1st base	BUF-3030	Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 150 mM NaCl.
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416
Skim Milk for immunoassay	Nacalai Tesque	31149-75
WesternBright Sirius-femtogram HRP	Advansta	K12043
Antibody for β-actin (C4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-47778	Lot number: C0916
MiSeq system	Illumina	SY-410-1003
NanoDrop spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-2000
Qubit fluorometer	Thermo Scientific	Q33226
EVOS FL Cell Imaging System	Thermo Scientific	AMF4300
CRISPR plasmid: pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)	Addgene	48138	Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA	Addgene	61591	Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: xCas9 3.7	Addgene	108379	Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.
CRISPR plasmid: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9	Addgene	42230	Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: hCas9	Addgene	41815	Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.
CRISPR plasmid: eSpCas9(1.1)	Addgene	71814	Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: VP12 (SpCas9-HF1)	Addgene	72247	Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.

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Liu, K. I., Sutrisnoh, N. B., Wang, Y., Tan, M. H. Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas. J. Vis. Exp. (146), e59086, doi:10.3791/59086 (2019).