Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Kaiwen  Ivy Liu; Norfala-Aliah  Binte Sutrisnoh; Yuanming Wang; Meng How Tan

doi:10.3791/59086

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Genetics

Genom-Bearbeitung in Säugetieren Zelllinien mit CRISPR-Cas

Published: April 11, 2019

doi:

10.3791/59086

Kaiwen Ivy Liu, Norfala-Aliah Binte Sutrisnoh, Yuanming Wang², Meng How Tan²

¹Genome Institute of Singapore,Agency for Science Technology and Research, ²School of Chemical and Biomedical Engineering,Nanyang Technological University

Summary

CRISPR-Cas ist eine leistungsstarke Technologie, die komplexe Genome von Pflanzen und Tieren zu entwickeln. Hier zeigen wir ein Protokoll, das menschliche Genom mit verschiedenen Cas jedoch effizient zu bearbeiten. Wir markieren wichtige Überlegungen und Design-Parameter zur Optimierung der Bearbeitung Effizienz.

Abstract

Die gruppierten regelmäßig dazwischen kurze palindromische Wiederholungen (CRISPR) System funktioniert natürlich in bakteriellen adaptive Immunität, sondern hat erfolgreich für Genom-Engineering in vielen verschiedenen Lebewesen zweckentfremdet worden. In den meisten Fällen der Wildtyp CRISPR verbundenen 9 (Cas9) oder Cas12a Endonuklease wird verwendet, um bestimmte Stellen im Genom, Spalten, nach denen die DNA-Doppelstrang-Pause über die nicht-homologe Ende verbinden (NHEJ) Weg oder die Reparatur unter der Regie von Homologie (repariert wird HDR) Weg, je nachdem, ob eine Spender Vorlage abwesend oder bzw. zu präsentieren. Bisher wurden die CRISPR-Systeme von verschiedenen Bakterienarten durchführen, Genom-Bearbeitung in Säugetierzellen werden gezeigt. Jedoch trotz der scheinbaren Einfachheit der Technik mehrere Design-Parameter berücksichtigt werden müssen, die oft Benutzer verwirrt darüber, wie am besten ihr Genom Bearbeitung Experimente durchführen lassen. Hier beschreiben wir einen kompletten Workflow von Versuchsanordnung zur Identifikation von Zellklonen, die gewünschte DNA-Modifikationen, mit dem Ziel der Erleichterung der erfolgreichen Ausführung des Genoms Bearbeitung Experimente in Säugetieren Zelllinien zu tragen. Wir markieren wichtige Überlegungen für die Nutzer zu beachten, einschließlich der Auswahl der CRISPR-System, die Abstandhalter Länge und das Design eine einzelsträngige Oligodeoxynucleotide (SsODN)-Spender-Vorlage. Wir uns vorstellen, dass dieses Workflows nützlich für gen Knockout Studien, Modellierung Bemühungen, Krankheit oder die Generation der Reporter Zellinien.

Introduction

Die Fähigkeit, das Genom jeder lebende Organismus Ingenieur hat viele biomedizinische und biotechnologische Anwendungen, wie die Korrektur von krankheitserregenden Mutationen, Bau der korrekte Zellmodellen für Krankheit Studien oder Erzeugung von landwirtschaftlichen Pflanzen mit gewünschten Eigenschaften. Seit der Wende des Jahrhunderts, verschiedene Technologien wurden entwickelt für Genom-Engineering in Säugerzellen, einschließlich Meganucleases¹^,²^,³, Zink-Finger Nukleasen⁴^,⁵, oder Transkription-Aktivator-ähnliche Effektor Nukleasen (TALENs)⁶^,⁷^,⁸^,⁹. Allerdings sind dieser früheren Technologien schwierig, Programm oder mühsam zu montieren, dabei behindern ihre Verbreitung in Forschung und Industrie.

In den letzten Jahren die gruppierten regelmäßig dazwischen kurze palindromische Wiederholungen (CRISPR) – CRISPR-assoziierten (Cas) System ist als eine mächtige neue Genom engineering Technologie¹⁰^,¹¹aufgetaucht. Ursprünglich eine adaptive Immunsystem in Bakterien, es wurde erfolgreich eingesetzt für Genom-Modifikation in Pflanzen und Tieren einschließlich des Menschen. Einer der Hauptgründe warum CRISPR-Cas in so kurzer Zeit so viel Popularität gewonnen hat ist, dass das Element, das die wichtigsten Cas Endonuklease, z. B. Cas9 oder Cas12a (auch bekannt als Cpf1) bringt, an die richtige Stelle im Genom ist einfach ein kurzes Stück der Chimären einzelne Führer RN A (SgRNA) ist das Design einfach und billig zu synthetisieren. Nach an den Zielstandort rekrutiert, die Cas-Enzym fungiert als molekulare Schere und bindet sich die gebundene DNA mit seiner RuvC, Unsichern oder Nuc Domänen¹²^,¹³^,¹⁴. Daraus resultierende gestrandeten Doppelunterbrechung (DSB) wird anschließend durch die Zellen entweder über die nicht-homologe Ende verbinden (NHEJ) oder unter der Regie von Homologie Reparatur (HDR) Weg repariert. In Ermangelung einer Reparatur Vorlage der DSB Reparaturen durch die fehleranfällige NHEJ Weg, der pseudo-zufälligen einfügen oder Löschen von Nukleotiden (Indels) an der geschliffenen Stelle hervorrufen kann, verursachen und Frameshift-Mutationen im Protein-kodierenden Gene. Jedoch ist in der Gegenwart eine Spender-Vorlage, die die gewünschten DNS-Änderungen enthält, die DSB durch die High-Fidelity-HDR-Weg repariert. Allgemeine Arten der Spender Vorlagen gehören einsträngige Oligonukleotide (SsODNs) und Plasmide. Das ehemalige wird normalerweise verwendet, wenn die beabsichtigte DNA-Veränderungen (z. B. Änderung von einem einzigen Basenpaar), klein sind, während letztere in der Regel verwendet wird wenn man eine relativ lange Sequenz einfügen will (z. B. die kodierende Sequenz ein grün fluoreszierendes Protein oder GFP) in den Target Locus.

Die Endonuklease-Aktivität des Proteins Cas erfordert die Anwesenheit von ein Protospacer angrenzenden Motiv (PAM) in die Ziel-Seite¹⁵. PAM Cas9 ist am 3′ Ende der Protospacer, während die PAM Cas12a (auch Cpf1 genannt) am 5′-Ende statt¹⁶. Der Cas-Guide RNA Komplex ist nicht in der Lage, ein DSB einführen, wenn die PAM abwesend¹⁷. Daher stellt die PAM eine Einschränkung für die genomische Standorte einer bestimmten Cas-Nuklease in der Lage ist zu Spalten. Zum Glück weisen Cas Nukleasen aus verschiedenen Bakterienarten in der Regel unterschiedliche PAM-Anforderungen. Daher können wir durch die Integration verschiedener CRISPR-Cas-Systeme in unserer engineering-Toolbox, die Palette der Websites erweitern, die in einem Genom ausgerichtet werden kann. Darüber hinaus kann ein natürliches Enzym Cas entwickelt oder weiterentwickelt, um alternative PAM folgen, weitere Ausweitung des Geltungsbereichs der genomischen Ziele für Manipulation¹⁸^,¹⁹^,²⁰zugänglich zu erkennen.

Obwohl mehrere CRISPR-Cas-Systeme für technische Zwecke Genom verfügbar sind, haben die meisten Anwender der Technologie vor allem auf die Cas9-Nuklease von Streptococcus Pyogenes (SpCas9) aus mehreren Gründen verlassen. Erstens bedarf es einem relativ einfach NGG PAM, im Gegensatz zu vielen anderen Cas-Proteinen, die nur in Anwesenheit von komplexeren PAMs Spalten können. Zweitens ist es die erste Cas-Endonuklease erfolgreich in menschlichen Zellen²¹^,²²^,²³^,²⁴eingesetzt werden. Drittens ist SpCas9 bei weitem das am besten charakterisierten Enzym bis heute. Wenn ein Forscher einen anderen Cas-Nuklease nutzen möchte, wäre er oder sie oft unklar, wie am besten zu entwerfen, das Experiment und wie gut andere Enzyme in verschiedenen biologischen zusammenhängen, die im Vergleich zu SpCas9 führen werden.

Um Klarheit für die relative Performance der verschiedenen CRISPR-Cas-Systeme zu schaffen, haben wir vor kurzem einen systematischen Vergleich der fünf Cas Endonucleases – SpCas9, das Cas9-Enzym von Staphylococcus Aureus (SaCas9), das Cas9 Enzym aus durchgeführt. Neisseria Meningitidis (NmCas9), das Cas12a Enzym aus Acidaminococcus SP. BV3L6 (AsCas12a) und das Cas12a Enzym aus Lachnospiraceae Bakterium ND2006 (LbCas12a)²⁵. Für einen fairen Vergleich haben wir die verschiedenen Cas-Nukleasen mit dem gleichen Satz von Ziel-Sites und anderen experimentellen Bedingungen ausgewertet. Die Studie auch abgegrenzt-Design-Parameter für jedes CRISPR-Cas-System, das als nützliches Nachschlagewerk für Anwender der Technologie dienen würde. Hier, besser es Wissenschaftlern ermöglichen, nutzen Sie das CRISPR-Cas-System, bieten wir eine Schritt für Schritt Protokoll für optimale Genom Engineering mit verschiedenen Cas9 und Cas12a Enzyme (siehe Abbildung 1). Das Protokoll enthält nicht nur experimentelle Details aber auch wichtige Überlegungen, die Wahrscheinlichkeit eines erfolgreichen Genom engineering Ergebnisses in Säugetierzellen zu maximieren.

Abbildung 1 : Ein Überblick über den Workflow Genom generieren bearbeitet humanen Zelllinien. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Protocol

1. Aufbau des sgRNAs Wählen Sie ein geeignetes CRISPR-Cas-System. Erstens prüfen der Zielregion für die PAM-Sequenzen von allen Cas9 und Cas12a Nukleasen, die nachweislich in Säugerzellen16,21-32funktionsfähig sein. Fünf häufigsten verwendeten Enzyme sind in Tabelle 1 zusammen mit ihren jeweiligen PAMs aufgeführt.Hinweis: Neben den Endonucleases in Tabelle 1aufgeführt, es gibt andere weniger häufig verwendete Cas-Enzyme, die erfolgreich in Säug…

Representative Results

Durchführen ein Genoms Bearbeitung Experiment, ein CRISPR-Plasmid mit dem Ausdruck eine SgRNA Ausrichtung braucht die Locus-of-Interest geklont werden. Erstens ist das Plasmid mit einem Restriktionsenzym (in der Regel eine Art IIs Enzym) um es zu linearisieren verdaut. Es wird empfohlen, das verdaute Produkt auf einem 1 % Agarose-Gel neben einem unverdauten Plasmid zu unterscheiden, eine komplette und partielle Verdauung zu lösen. Da unverdaute Plasmide supercoiled sind, neigen sie, schneller als ihre Gegenstücke line…

Discussion

Das CRISPR-Cas-System ist eine leistungsstarke, revolutionäre Technologie, die Genome und Transkriptom von Pflanzen und Tieren zu entwickeln. CRISPR-Cas-Systeme enthalten, die möglicherweise für Genom und technische Zwecke⁴⁴Transkriptom angepasst wurden zahlreiche Bakterienarten gefunden. Obwohl die Cas9 Endonuklease von Streptococcus Pyogenes (SpCas9) war das erste Enzym erfolgreich in menschlichen Zellen²¹^,²²^,<sup …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

M.HS wird unterstützt von einer Agentur für Wissenschaft, Technologie und Forschung gemeinsame Ratsbüro Grant (1431AFG103), ein National Medical Research Council zu gewähren (OFIRG/0017/2016), National Research Foundation gewährt (NRF2013-THE001-046 und NRF2013-THE001-093), eine Ministerium der Ausbildung Stufe 1 Grant (RG50/17 (S)), ein Start-up gewähren von Nanyang Technological University, und die Mittel für die International genetisch Engineering Machine (iGEM) Wettbewerb der Nanyang Technological University.

Materials

T4 Polynucleotide Kinase (PNK)	NEB	M0201
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)	NEB	M0371
Tris-Acetate-EDTA (TAE) Buffer, 50X	1st Base	BUF-3000-50X4L	Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 40 mM Tris, 20 mM acetic acid, and 1 mM EDTA.
Tris-EDTA (TE) Buffer, 10X	1st Base	BUF-3020-10X4L	Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 10 mM Tris (pH 8.0) and 1 mM EDTA.
BbsI	NEB	R0539
BsmBI	NEB	R0580
T4 DNA Ligase	NEB	M0202	400,000 units/ml
Quick Ligation Kit	NEB	M2200	An alternative to T4 DNA Ligase.
Rapid DNA Ligation Kit	Thermo Scientific	K1423	An alternative to T4 DNA Ligase.
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit	Thermo Scientific	451245	The salt solution comes with the TOPO vector in the kit.
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	NEB	E2621L	Kit for Gibson assembly.
One Shot Stbl3 Chemically Competent E.Coli	Thermo Scientific	C737303
LB Broth (Lennox), powder	Sigma Aldrich	L3022	Reconstitute in ddH₂0, and autoclave before use
LB Broth with Agar (Lennox), powder	Sigma Aldrich	L2897	Reconstitute in ddH₂0, and autoclave before use
SOC media	–	–	2.5 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 20 mM glucose in 1 L of LB Broth
Ampicillin (Sodium), USP Grade	Gold Biotechnology	A-301
REDiant 2X PCR Mastermix	1st Base	BIO-5185
Agarose	1st Base	BIO-1000
T7 Endonuclease I	NEB	M0302
Plasmid DNA Extraction Miniprep Kit	Favorgen	FAPDE 300
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose	Hyclone	SH30081.01	4.5 g/L Glucose, no L-glutamine, HEPES and Sodium Pyruvate
L-Glutamine, 200mM	Gibco	25030
Penicillin-Streptomycin, 10, 000U/mL	Gibco	15140
0.25% Trypsin-EDTA, 1X	Gibco	25200
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SV30160	FBS is heat inactivated before use at 56 ^oC for 30 min
Phosphate Buffered Saline, 1X	Gibco	20012
jetPRIME transfection reagent	Polyplus Transfection	114-75
QuickExtract DNA Extraction Solution, 1.0	Epicentre	LUCG-QE09050
ISOLATE II Genomic DNA Kit	Bioline	BIO-52067	An alternative to QuickExtract
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	M0491
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix	NEB	N0447
6X DNA Loading Dye	Thermo Scientific	R0611	10 mM Tris-HCl (pH 7.6) 0.03% bromophenol blue, 0.03% xylene cyanol FF, 60% glycerol, 60 mM EDTA
Protease Inhibitor Cocktail, Set3	Merck	539134
Nitrocellulose membrane, 0.2µm	Bio-Rad	1620112
Tris-glycine-SDS buffer, 10X	Bio-Rad	1610772	Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris, 192 mM glycine, and 0.1% SDS.
Tris-glycine buffer, 10X	1st base	BUF-2020	Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris and 192 mM glycine.
Ponceau S solution	Sigma Aldrich	P7170
TBS, 20X	1st base	BUF-3030	Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 150 mM NaCl.
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416
Skim Milk for immunoassay	Nacalai Tesque	31149-75
WesternBright Sirius-femtogram HRP	Advansta	K12043
Antibody for β-actin (C4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-47778	Lot number: C0916
MiSeq system	Illumina	SY-410-1003
NanoDrop spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-2000
Qubit fluorometer	Thermo Scientific	Q33226
EVOS FL Cell Imaging System	Thermo Scientific	AMF4300
CRISPR plasmid: pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)	Addgene	48138	Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA	Addgene	61591	Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: xCas9 3.7	Addgene	108379	Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.
CRISPR plasmid: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9	Addgene	42230	Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: hCas9	Addgene	41815	Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.
CRISPR plasmid: eSpCas9(1.1)	Addgene	71814	Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: VP12 (SpCas9-HF1)	Addgene	72247	Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.

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Liu, K. I., Sutrisnoh, N. B., Wang, Y., Tan, M. H. Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas. J. Vis. Exp. (146), e59086, doi:10.3791/59086 (2019).