Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Kaiwen  Ivy Liu; Norfala-Aliah  Binte Sutrisnoh; Yuanming Wang; Meng How Tan

doi:10.3791/59086

JoVE Journal > Genetics

Genetics

Genomet redigering i pattedyr linjer med CRISPR-Cas

Published: April 11, 2019

doi:

10.3791/59086

Kaiwen Ivy Liu, Norfala-Aliah Binte Sutrisnoh, Yuanming Wang², Meng How Tan²

¹Genome Institute of Singapore,Agency for Science Technology and Research, ²School of Chemical and Biomedical Engineering,Nanyang Technological University

Summary

CRISPR-Cas er en kraftig teknologi til ingeniør komplekse genomer av planter og dyr. Her, detalj vi en protokoll effektivt redigere det menneskelige genomet bruker forskjellige Cas-endonucleases. Vi markere viktige hensyn og design parametere for å optimalisere redigering effektivitet.

Abstract

Gruppert regelmessig interspaced kort palindromic gjentar (CRISPR) systemet fungerer naturlig bakteriell adaptiv immunitet, men har blitt vellykket repurposed genomet Engineering i mange forskjellige levende organismer. Oftest wildtype CRISPR tilknyttet 9 (Cas9) eller Cas12a endonuclease brukes til å holde seg bestemte nettsteder i genomet, hvoretter DNA double-strandet pause repareres via ikke-homologe slutten å bli (NHEJ) veien eller homologi-rettet reparasjon ( HDR) sti avhengig av om en giver mal er fraværende eller presentere henholdsvis. Hittil har CRISPR systemer fra ulike bakterie-art vist å kunne utføre genomet redigering i pattedyrceller. Men til tross for den tilsynelatende enkelheten av teknologi må flere design parametere vurderes, som ofte lar brukerne rådvill om hvordan best for å utføre sine genom redigering eksperimenter. Her beskriver vi en komplett arbeidsflyt fra experimental design til identifikasjon av cellen kloner som bærer DNA endringer, med mål om å tilrettelegge vellykket gjennomføring av genomet redigering eksperimenter i pattedyr linjer. Vi markere nøkkelfaktorer for brukere å merke, inkludert valg av CRISPR system, hvor mellomrom og utformingen av en enkelt-strandet oligodeoxynucleotide (ssODN) giver mal. Vi forventer at denne arbeidsflyten vil være nyttig for genet knockout studier, sykdom modellering innsats, eller generering av reporteren cellelinjer.

Introduction

Muligheten til å ingeniør genomet av enhver levende organisme har mange biomedisinsk og bioteknologisk programmer, for eksempel korrigering av sykdomsfremkallende mutasjoner, bygging av nøyaktige mobilnettet modeller for sykdom studier eller generering av landbruket vekster med ønskelig egenskaper. Siden begynnelsen av århundret, ulike teknologier er utviklet for genomet engineering i pattedyrceller, inkludert meganucleases¹^,²^,³, sink finger nucleases⁴^,⁵, eller transkripsjon aktivator som effektor nucleases (TALENs)⁶^,⁷^,⁸^,⁹. Men er disse tidligere teknologiene vanskelig å programmet eller kjedelig å montere, og dermed hindrer deres utbredt adopsjon i forskning og industri.

De siste årene, de klynget interspaced regelmessig kort palindromic gjentar (CRISPR) – CRISPR-assosiert (Cas) systemet har dukket opp som en kraftig ny genomet engineering teknologi¹⁰^,¹¹. Opprinnelig en adaptive immunsystemet i bakterier, det har blitt deployert for genomet endring i planter og dyr, inkludert mennesker. Hovedårsak hvorfor CRISPR-Cas har fått så mye popularitet i så kort tid er at elementet som bringer den viktigste Cas-endonuclease, som Cas9 eller Cas12a (også kjent som Cpf1), til riktig sted i genomet er bare et kort stykke chimeric enkelt støttelinje RN En (sgRNA), som er enkelt å utforme og billig å syntetisere. Etter blir rekruttert til målområdet, Cas enzymet fungerer som et par molekylær saks og innstiftet bundet DNA med sin RuvC, HNH eller Nuc domener¹²^,¹³^,¹⁴. Resulterende dobbel strandet pause (DSB) repareres senere av cellene via enten ikke-homologe slutten med (NHEJ) eller homologi-rettet reparasjon (HDR) veien. I fravær av en reparasjon mal repareres DSB av feilutsatte NHEJ veien, som kan gi opphav til pseudo-tilfeldige innsetting eller sletting av nukleotider (indeler) på webområdet kutt, potensielt forårsake frameshift mutasjoner i protein-koding gener. Men i nærvær av en donor mal som inneholder endringene i DNA, er DSB reparert av Hi-Fi HDR veien. Vanlige typer donor maler inkluderer enkelt-strandet oligonucleotides (ssODNs) og plasmider. Tidligere brukes vanligvis hvis tiltenkte DNA endringene er små (for eksempel endring av en enkelt base-par), mens sistnevnte brukes vanligvis hvis man ønsker å sette inn en relativt lang sekvens (for eksempel koding sekvensen av en grønn fluorescerende protein eller GFP) i målet locus.

Endonuclease aktiviteten til Cas protein krever tilstedeværelse av en protospacer tilstøtende motiv (PAM) mål område¹⁵. PAM Cas9 er på 3 slutten av protospacer, PAM Cas12a (også kalt Cpf1) er på 5′ slutten i stedet¹⁶. Cas-guiden RNA komplekse er ikke innføre en DSB hvis PAM er fraværende¹⁷. Derfor plasserer PAM en begrensning på genomisk stedene der en bestemt Cas-nuclease er i stand til å holde seg. Heldigvis viser Cas nucleases fra ulike bakterie-art vanligvis ulike PAM krav. Ved å integrere ulike CRISPR-Cas systemer i våre tekniske verktøykassen, kan vi derfor utvide omfanget av nettsteder som kan målrettes i et genom. Videre kan et naturlig Cas enzym være konstruert eller utviklet for å gjenkjenne alternativ PAM sekvenser, ytterligere utvide omfanget av genomisk mål tilgjengelig for manipulasjon¹⁸^,¹⁹^,²⁰.

Selv om flere CRISPR-Cas-systemer finnes genomet engineering formål, har de fleste brukere av teknologi stolt på Cas9 nuclease fra Streptococcus pyogenes (SpCas9) av flere grunner. Først krever det en relativt enkelt NGG PAM, i motsetning til mange andre sertifiseringsinstanser proteiner som kan bare holde seg i nærvær av mer komplekse PAMs. Det andre er den første Cas endonuclease å bli distribuert i menneskeceller²¹^,²²^,²³^,²⁴. Tredje er SpCas9 langt den beste preget enzymet hittil. Hvis en forsker ønsker å bruke en annen Cas nuclease, vil han eller hun ofte være uklart om hvordan best å utforme eksperimentet og hvor godt andre enzymer vil opptre i ulike biologiske sammenhenger i forhold til SpCas9.

For å utdype den relative ytelsen til forskjellige CRISPR-Cas-systemer, har vi nylig utførte en systematisk Sammenlikning av fem Cas endonucleases-SpCas9, Cas9 enzymet fra Staphylococcus aureus (SaCas9), Cas9 enzymet fra Neisseria meningitidis (NmCas9), Cas12a enzymet fra Acidaminococcus sp. BV3L6 (AsCas12a) og Cas12a enzymet fra Lachnospiraceae bakterie ND2006 (LbCas12a)²⁵. For en rettferdig sammenligning vurdert vi de ulike Cas nucleases bruker samme sett med målområder og andre eksperimentelle forhold. Studien også avgrenset design parameterne for hver CRISPR-Cas-system, som ville tjene som en nyttig referanse for brukere av teknologi. Her, bedre aktiverer forskere å bruke CRISPR-Cas system, gir vi en trinnvis protokoll for optimal genomet engineering med forskjellige Cas9 og Cas12a enzymer (se figur 1). Protokollen inkluderer ikke bare eksperimentelle detaljer men også viktige Utformingshensyn å maksimere sannsynligheten for et vellykket genomet engineering resultat i pattedyrceller.

Figur 1 : En oversikt over arbeidsflyten skal generere genomet endret humane cellelinjer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Protocol

1. design av sgRNAs Velg en passende CRISPR-Cas-system. Først inspisere målregion for PAM sekvensene av alle Cas9 og Cas12a nucleases som har vist seg å fungere i pattedyrceller16,21-32. Fem brukte enzymer er gitt i tabell 1 sammen med deres respektive PAMs.Merk: i tillegg til endonucleases oppført i tabell 1, det finnes andre mindre brukte Cas enzymer som har blitt distribuert i pattedyrceller også, som en Cas9 nuclease fra Streptococcus thermop…

Representative Results

Utføre et genom redigering eksperiment, en CRISPR plasmider uttrykke en sgRNA rettet mot den locus steder skal klones. Først er plasmider fordøyd med en begrensning enzym (vanligvis en type IIs enzym) å linearize den. Det anbefales å løse fordøyd produktet på en 1% agarose gel sammen med en ufordøyd plasmider å skille mellom en fullstendig og delvis fordøyelsen. Som ufordøyd plasmider er supercoiled, pleier de å kjøre raskere enn sine linearisert kolleger (se figur 7en<…

Discussion

CRISPR-Cas systemet er en kraftig og revolusjonerende teknologi til ingeniør genomes og transcriptomes av planter og dyr. Mange bakteriell arter er funnet for å inneholde CRISPR-Cas-systemer, som kan være tilpasset genom og transcriptome engineering formål⁴⁴. Selv om Cas9 endonuclease fra Streptococcus pyogenes (SpCas9) var den første enzymet distribueres vellykket i menneskeceller²¹^,²²^,²³<s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

M.H.T. støttes av et byrå for vitenskap teknologi og Research felles rådet Office grant (1431AFG103), gir en National Medical Research Council (OFIRG/0017/2016), National Research Foundation gir (NRF2013-THE001-046 og NRF2013-THE001-093), en Departementet for utdanning Tier 1 grant (RG50-17 (S)), en oppstart gi fra Nanyang Technological University, og midler til internasjonale genetisk Engineering maskin (iGEM) konkurransen fra Nanyang Technological University.

Materials

T4 Polynucleotide Kinase (PNK)	NEB	M0201
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)	NEB	M0371
Tris-Acetate-EDTA (TAE) Buffer, 50X	1st Base	BUF-3000-50X4L	Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 40 mM Tris, 20 mM acetic acid, and 1 mM EDTA.
Tris-EDTA (TE) Buffer, 10X	1st Base	BUF-3020-10X4L	Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 10 mM Tris (pH 8.0) and 1 mM EDTA.
BbsI	NEB	R0539
BsmBI	NEB	R0580
T4 DNA Ligase	NEB	M0202	400,000 units/ml
Quick Ligation Kit	NEB	M2200	An alternative to T4 DNA Ligase.
Rapid DNA Ligation Kit	Thermo Scientific	K1423	An alternative to T4 DNA Ligase.
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit	Thermo Scientific	451245	The salt solution comes with the TOPO vector in the kit.
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	NEB	E2621L	Kit for Gibson assembly.
One Shot Stbl3 Chemically Competent E.Coli	Thermo Scientific	C737303
LB Broth (Lennox), powder	Sigma Aldrich	L3022	Reconstitute in ddH₂0, and autoclave before use
LB Broth with Agar (Lennox), powder	Sigma Aldrich	L2897	Reconstitute in ddH₂0, and autoclave before use
SOC media	–	–	2.5 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 20 mM glucose in 1 L of LB Broth
Ampicillin (Sodium), USP Grade	Gold Biotechnology	A-301
REDiant 2X PCR Mastermix	1st Base	BIO-5185
Agarose	1st Base	BIO-1000
T7 Endonuclease I	NEB	M0302
Plasmid DNA Extraction Miniprep Kit	Favorgen	FAPDE 300
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose	Hyclone	SH30081.01	4.5 g/L Glucose, no L-glutamine, HEPES and Sodium Pyruvate
L-Glutamine, 200mM	Gibco	25030
Penicillin-Streptomycin, 10, 000U/mL	Gibco	15140
0.25% Trypsin-EDTA, 1X	Gibco	25200
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SV30160	FBS is heat inactivated before use at 56 ^oC for 30 min
Phosphate Buffered Saline, 1X	Gibco	20012
jetPRIME transfection reagent	Polyplus Transfection	114-75
QuickExtract DNA Extraction Solution, 1.0	Epicentre	LUCG-QE09050
ISOLATE II Genomic DNA Kit	Bioline	BIO-52067	An alternative to QuickExtract
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	M0491
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix	NEB	N0447
6X DNA Loading Dye	Thermo Scientific	R0611	10 mM Tris-HCl (pH 7.6) 0.03% bromophenol blue, 0.03% xylene cyanol FF, 60% glycerol, 60 mM EDTA
Protease Inhibitor Cocktail, Set3	Merck	539134
Nitrocellulose membrane, 0.2µm	Bio-Rad	1620112
Tris-glycine-SDS buffer, 10X	Bio-Rad	1610772	Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris, 192 mM glycine, and 0.1% SDS.
Tris-glycine buffer, 10X	1st base	BUF-2020	Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris and 192 mM glycine.
Ponceau S solution	Sigma Aldrich	P7170
TBS, 20X	1st base	BUF-3030	Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 150 mM NaCl.
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416
Skim Milk for immunoassay	Nacalai Tesque	31149-75
WesternBright Sirius-femtogram HRP	Advansta	K12043
Antibody for β-actin (C4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-47778	Lot number: C0916
MiSeq system	Illumina	SY-410-1003
NanoDrop spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-2000
Qubit fluorometer	Thermo Scientific	Q33226
EVOS FL Cell Imaging System	Thermo Scientific	AMF4300
CRISPR plasmid: pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)	Addgene	48138	Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA	Addgene	61591	Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: xCas9 3.7	Addgene	108379	Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.
CRISPR plasmid: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9	Addgene	42230	Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: hCas9	Addgene	41815	Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.
CRISPR plasmid: eSpCas9(1.1)	Addgene	71814	Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: VP12 (SpCas9-HF1)	Addgene	72247	Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.

References

Epinat, J. C., et al. A novel engineered meganuclease induces homologous recombination in yeast and mammalian cells. Nucleic Acids Research. 31 (11), 2952-2962 (2003).
Arnould, S., et al. Engineered I-CreI derivatives cleaving sequences from the human XPC gene can induce highly efficient gene correction in mammalian cells. Journal of Molecular Biology. 371 (1), 49-65 (2007).
Chapdelaine, P., Pichavant, C., Rousseau, J., Paques, F., Tremblay, J. P. Meganucleases can restore the reading frame of a mutated dystrophin. Gene Therapy. 17 (7), 846-858 (2010).
Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetics. 188 (4), 773-782 (2011).
Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).
Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nature Biotechnology. 29 (2), 143-148 (2011).
Zhang, F., et al. Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription. Nature Biotechnology. 29 (2), 149-153 (2011).
Boch, J., et al. Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors. Science. 326 (5959), 1509-1512 (2009).
Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 326 (5959), 1501 (2009).
Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
Nishimasu, H., et al. Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA. Cell. 156 (5), 935-949 (2014).
Yamano, T., et al. Crystal Structure of Cpf1 in Complex with Guide RNA and Target DNA. Cell. 165 (4), 949-962 (2016).
Swarts, D. C., Mosterd, C., van Passel, M. W., Brouns, S. J. CRISPR interference directs strand specific spacer acquisition. PLoS One. 7 (4), e35888 (2012).
Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).
Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
Kleinstiver, B. P., et al. Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition. Nature Biotechnology. 33 (12), 1293-1298 (2015).
Kleinstiver, B. P., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature. 523 (7561), 481-485 (2015).
Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. Elife. 2, e00471 (2013).
Cho, S. W., Kim, S., Kim, J. M., Kim, J. S. Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nature Biotechnology. 31 (3), 230-232 (2013).
Wang, Y., et al. Systematic evaluation of CRISPR-Cas systems reveals design principles for genome editing in human cells. Genome Biology. 19 (1), 62 (2018).
Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
Hou, Z., et al. Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (39), 15644-15649 (2013).
Kim, E., et al. In vivo genome editing with a small Cas9 orthologue derived from Campylobacter jejuni. Nature Communications. 8, 14500 (2017).
Edraki, A., et al. A Compact, High-Accuracy Cas9 with a Dinucleotide PAM for In Vivo Genome Editing. Molecular Cell. , (2018).
Chatterjee, P., Jakimo, N., Jacobson, J. M. Minimal PAM specificity of a highly similar SpCas9 ortholog. Science Advances. 4 (10), (2018).
Muller, M., et al. Streptococcus thermophilus CRISPR-Cas9 Systems Enable Specific Editing of the Human Genome. Mol Therapy. 24 (3), 636-644 (2016).
Esvelt, K. M., et al. Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing. Nature Methods. 10 (11), 1116-1121 (2013).
Boratyn, G. M., et al. BLAST: a more efficient report with usability improvements. Nucleic Acids Research. 41 (Web Server issue), W29-W33 (2013).
Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Research. 42 (Web Server issue), W401-W407 (2014).
Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nature Methods. 11 (2), 122-123 (2014).
Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
Bae, S., Park, J., Kim, J. S. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).
Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).
Richardson, C. D., Ray, G. J., Bray, N. L., Corn, J. E. Non-homologous DNA increases gene disruption efficiency by altering DNA repair outcomes. Nature Communications. 7, 12463 (2016).
Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
Zhang, J. P., et al. Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage. Genome Biology. 18 (1), 35 (2017).
Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
Shmakov, S., et al. Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 169-182 (2017).
Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPR-Cpf1 mediates efficient homology-directed repair and temperature-controlled genome editing. Nature Communications. 8 (1), 2024 (2017).
Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, e04766 (2014).
Yang, L., et al. Optimization of scarless human stem cell genome editing. Nucleic Acids Research. 41 (19), 9049-9061 (2013).
Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Liu, K. I., Sutrisnoh, N. B., Wang, Y., Tan, M. H. Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas. J. Vis. Exp. (146), e59086, doi:10.3791/59086 (2019).