真似をして 3次元細胞培養の膵腺房の上皮化生を操作します。
Summary
原発の腺房細胞分離、蛋白質の表現や活動の変調、文化、およびダウン ストリーム アプリケーションは ex の豊富有用腺房の上皮化生 (ADM)、膵臓癌の開発の初期イベントに関する検討。
Abstract
膵炎と膵臓癌の開発の初期に腺房細胞の上皮細胞への分化は、さらなる研究を必要とする重要なプロセスです。メカニズムを理解するには、ex vivo 3次元培養とプライマリ腺房細胞上皮細胞への分化調節腺管上皮化生 (ADM) は、他のシステムに比べて多くの利点を提供しています。本技術は、タンパク質発現の調節は簡単かつ迅速、分離、刺激や、ウイルスに感染し ADM プロセスを調査するプライマリ腺房細胞の培養を開始 1 日だけを必要とします。基底膜マトリックス、播種コラーゲン腺房細胞クラスターの私細胞外マトリックスを使用するとは異なり操作前に自分の腺房のアイデンティティを保持する腺房細胞ができます。これは重要な司令官の誘導するさまざまなコンポーネントの貢献をテストするときサイトカインやその他の異所萌出へ投与の要因の効果はこのテクニックを通してテストであるだけでなく、共通の突然変異や増加蛋白質の表現、蛋白質の表現のノックダウンの貢献はのウイルス感染によるテストプライマリ腺房細胞は、アデノ ウイルスやレンチ ウイルスのベクトルを使用して。さらに、細胞は、コラーゲンまたはエンドポイントで基底膜マトリックスから再分離できるので、蛋白質の表現の分析します。
Introduction
腺房の上皮化生 (ADM) は、膵炎とさらに追究する必要があります膵臓癌開発1の運転キー プロセス中に保護メカニズムです。膵臓癌の場合3の 90% に存在する発癌性のKRAS変異が戻って、腺房表現型4,5,への分化を防ぐため炎症誘起 ADM はリバーシブル2が、6。 養殖と 3 d 培養上皮細胞にプライマリ腺房細胞の差別化は、生体内で調査することは困難である ADM プロセスを制御する分子機構の研究。このような生体は、ADM、そのドライバーとその制御因子のリアルタイム可視化を有効にします。その下流のシグナル伝達経路の追究と同様、ADM プロセスのいくつかのドライバー確認されています。 またはメソッドを説明したことを確認使用するここ。ADM TGF-α 変換成長因子誘導が含まれます-mmp-7 (マトリックス マトリックスメタロプロテアーゼ-7) の発現と RANTES (発現し、分泌される; また知られている正常な T 細胞活性化の制御と同様、ノッチ7の活性化を介したケモカイン リガンド 5 または CCL5) として、tnf α (腫瘍壊死因子 α)-NF-κ B (核因子 κ B)8の活性化を介して ADM を誘導します。ADM の追加調停は発癌 KRas9,10, ADM egfr (上皮成長因子受容体) 遺伝子の発現の増加過程とその配位子、EGF (強化酸化ストレスの上昇を引き起こす表皮成長因子) と TGF α11。
膵癌細胞株の in vitro 試験の共通は、一次電池文化は、多くの利点を提供しています。たとえば、非トランスジェニック マウスまたはKrasG12Dなど、開始遺伝子変異マウスからプライマリ腺房細胞は細胞数と制御遺伝子を持っているので ADM の初期イベントを研究するための最も適切なモデルを膵臓癌の開発の初期段階に存在する知られています。これは対照的に複数の変異を持つ多くの膵臓癌細胞株に通路番号12に基づく表現を変化させると。さらに、このような手段によって識別されるシグナル伝達経路は、動物実験によって検証されています。プライマリ腺房細胞を使用しての 1 つの警告は、典型的な癌細胞株はできるだけトランスフェクションできないのことです。
メソッドをここは、腺房細胞分離、覚醒剤を追加または、アデノ ウイルスやレンチ ウイルス感染だけでなく、さらなる分析のエンドポイントで細胞の再分離経由タンパク質の発現を調節することにより ADM を模した 3 D の文化の技術を詳しく説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
分離、感染、およびプライマリ腺房細胞のメッキのための時間の比較的短い時間は、この方法の利点です。対照的に、少し実践的な時間が必要ですが植副産物から腺房細胞を培養、腺房細胞13の副産物に 7 日ほどかかります。腺房分離14代替プロトコル ノート腺房細胞を取得する非常に簡単な方法しかし、EGF は、腺房細胞がそのプロトコルを使用して分離?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この仕事に支えられ R01 グラント (CA200572)、NIH から PS へ内容は、著者の責任国立がん研究所の公式見解を必ずしも表さないまたは輸出国家機関の資金提供者の役割がなかった研究デザイン、データの収集と分析、意思決定に発行、または原稿の準備。
Materials
| 37 °C shaking incubator | Thermo Scientific | SHKE4000-7 | |
| 5% CO2, 37 °C Incubator | NUAIRE | NU-5500 | |
| 50 ml tubes | Falcon | 352070 | |
| Absorbent pad, 20" x 24" | Fisherbrand | 1420662 | |
| Adenovirus, Ad-GFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Aluminum foil | Fisherbrand | 01-213-101 | |
| BD Precision Glide Needle 21G x 1/2 | Fisher Scientific | 305167 | Use as pins for dissection |
| Beaker, 600 mL | Fisherbrand | FB-101-600 | |
| Bleach, 8.25% | Clorox | 31009 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Referred to as 'basement membrane matrix recovery solution' in the manuscript. |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-15R Centrifuge | |
| Collagenase Type I, Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | Create a 100 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water. When thawing one aliquot, dilute to 10 mg/ml, filter sterilize and place 1 ml aliquots at -20 °C. |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | Create a 4 mg/ml solution by dissolving powder in methanol, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Ethanol, 200 proof | Decon Laboratories | 2701 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926-100mL | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91127-12 | |
| Glass slide, 8-well | Lab-Tek | 177402 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), No calcium, No magnesium, No phenol red | Fisher Scientific | SH3048801 | |
| Ice bucket, rectangular | Fisher Scientific | 07-210-103 | |
| Instant Sealing Sterilization Pouch | Fisherbrand | 01-812-51 | |
| LAB GUARD specimen bags (for mouse after dissection) | Minigrip | SBL2X69S | |
| Lentiviral Packaging Mix, Virapower | Invitrogen | 44-2050 | |
| Matrigel | Corning | 356234 | Referred to as 'basement membrane matrix' in the manuscript. |
| Parafilm | Bemis | PM992 | Referred to as 'plastic paraffin film' in the manuscript. |
| PBS | Fisher Scientific | SH30028.02 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Pipet tips, 10 µl | USA Scientific | 1110-3700 | |
| Pipet tips, 1000 µl | Olympus Plastics | 24-165RL | |
| Pipet tips, 200 µl | USA Scientific | 1111-1700 | |
| Pipet-Aid | Drummond | ||
| PIPETMAN Classic P10, 1-10 μl | Gilson | F144802 | |
| PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 μl | Gilson | F123602 | |
| PIPETMAN Classic P20, 2-20 μl | Gilson | F123600 | |
| PIPETMAN Classic P200, 20-200 μl | Gilson | F123601 | |
| Pipettes, 10 ml | Falcon | 357551 | |
| Pipettes, 25 ml | Falcon | 357525 | |
| Pipettes, 5 ml | Falcon | 357543 | |
| Plate, 12-well | Corning Costar | 3513 | |
| Plate, 24-well plate | Corning Costar | 3524 | |
| Plate, 35 mm | Falcon | 353001 | |
| Plate, 6-well | Falcon | 353046 | |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003-G | Create a 40 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Polypropylene Mesh, 105 µm | Spectrum Labs | 146436 | |
| Polypropylene Mesh, 500 µm | Spectrum Labs | 146418 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14568-12 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Sodium Bicarbonate (Fine White Powder) | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 8 | Gibco | 17075029 | |
| Spatula | Fisherbrand | 21-401-10 | |
| Steriflip 50 ml, 0.22 micron filters | Millipore | SCGP00525 | |
| TGF-α | R&D Systems | 239-A-100 | |
| Type I Rat Tail Collagen | Corning | 354236 | |
| Waymouth MB 752/1 Medium (powder) | Sigma | W1625-10X1L | |
| Weigh boat, hexagonal, medium | Fisherbrand | 02-202-101 |
References
- Rooman, I., Real, F. X. Pancreatic ductal adenocarcinoma and acinar cells: a matter of differentiation and development. Gut. 61 (3), 449-458 (2012).
- Stanger, B. Z., Hebrok, M. Control of cell identity in pancreas development and regeneration. Gastroenterology. 144 (6), 1170-1179 (2013).
- Caldas, C., Kern, S. E. K-ras mutation and pancreatic adenocarcinoma. International Journal of Pancreatology. 18 (1), 1-6 (1995).
- Kopp, J. L., et al. Identification of Sox9-dependent acinar-to-ductal reprogramming as the principal mechanism for initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 22 (6), 737-750 (2012).
- Morris, J. P. t., Cano, D. A., Sekine, S., Wang, S. C., Hebrok, M. Beta-catenin blocks Kras-dependent reprogramming of acini into pancreatic cancer precursor lesions in mice. Journal of Clinical Investigation. 120 (2), 508-520 (2010).
- Grippo, P. J., Nowlin, P. S., Demeure, M. J., Longnecker, D. S., Sandgren, E. P. Preinvasive pancreatic neoplasia of ductal phenotype induced by acinar cell targeting of mutant Kras in transgenic mice. Cancer Research. 63 (9), 2016-2019 (2003).
- Sawey, E. T., Johnson, J. A., Crawford, H. C. Matrix metalloproteinase 7 controls pancreatic acinar cell transdifferentiation by activating the Notch signaling pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19327-19332 (2007).
- Liou, G. Y., et al. Macrophage-secreted cytokines drive pancreatic acinar-to-ductal metaplasia through NF-kappaB and MMPs. Journal of Cell Biology. 202 (3), 563-577 (2013).
- De La, O. J., et al. Notch and Kras reprogram pancreatic acinar cells to ductal intraepithelial neoplasia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18907-18912 (2008).
- Habbe, N., et al. Spontaneous induction of murine pancreatic intraepithelial neoplasia (mPanIN) by acinar cell targeting of oncogenic Kras in adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18913-18918 (2008).
- Liou, G. Y., et al. Mutant KRas-Induced Mitochondrial Oxidative Stress in Acinar Cells Upregulates EGFR Signaling to Drive Formation of Pancreatic Precancerous Lesions. Cell Report. 14 (10), 2325-2336 (2016).
- Hughes, P., Marshall, D., Reid, Y., Parkes, H., Gelber, C. The costs of using unauthenticated, over-passaged cell lines: how much more data do we need. Biotechniques. 43 (5), 577-578 (2007).
- Blauer, M., Nordback, I., Sand, J., Laukkarinen, J. A novel explant outgrowth culture model for mouse pancreatic acinar cells with long-term maintenance of secretory phenotype. European Journal of Cell Biology. 90 (12), 1052-1060 (2011).
- Gout, J., et al. Isolation and culture of mouse primary pancreatic acinar cells. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging cells in three-dimensional collagen matrix. Current Protocols in Cell Biology. , 11-20 (2010).
- Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. Revealing the cytoskeletal organization of invasive cancer cells in 3D. Journal of Visualized Experiments. (80), e50763 (2013).
