מחקה וטיפול מטפלזיה Acinar-כדי-Ductal הלבלב בתרבות תלת-ממדי תא
Summary
בידוד תא acinar הראשית, אפנון ביטוי או פעילות החלבון, תרבות ויישומים למטה-נחל הם בשפע שימושי לשעבר מחקר vivo של acinar-כדי-ductal מטפלזיה (ADM), אירוע מוקדם בהתפתחות של סרטן הלבלב.
Abstract
הבידול של תאים acinar תאי ductal במהלך לבלב, בפיתוח מוקדם של סרטן הלבלב הוא תהליך מפתח זה דורש מחקר נוסף. כדי להבין את מנגנוני ויסות מטפלזיה acinar-כדי-ductal (ADM), ex-vivo תרבות תלת-ממד, התמיינות של תאים acinar העיקרי על תאי ductal מציע יתרונות רבים על פני מערכות אחרות. עם הטכניקה בזאת, אפנון של ביטוי חלבון היא פשוטה ומהירה, המחייב רק יום אחד כדי לבודד, לעורר או לשווק להדביק, ולהתחיל culturing תאים acinar העיקרית לחקור את תהליך ה-ADM. בניגוד באמצעות מטריצת קרום המרתף, זריעה של תא acinar אשכולות של קולגן אני מטריצה חוץ-תאית, מאפשר acinar תאים לשמור על זהותם acinar לפני מניפולציה. זה חיוני בעת בדיקת התרומה של רכיבים שונים אינדוקציה של אדמירל תופעות של ציטוקינים או גורמים אחרים ectopically מנוהלת ברת באמצעות טכניקה זו, לא רק התרומה של מוטציות נפוצות, ביטוי חלבון מוגבר או נוקאאוט של ביטוי חלבון היא ברת דרך זיהום ויראלי של ראשי תאים acinar באמצעות וקטורים adenoviral או lentiviral. יתר על כן, התאים ניתן לבודד מחדש קולגן או קרום המרתף מטריקס-נקודת הקצה, ניתחו ביטוי חלבון.
Introduction
Acinar-אל-ductal מטפלזיה (ADM) היא מנגנון הגנה במהלך דלקת לבלב, תהליך מפתח נהיגה התפתחות סרטן הלבלב1 שדורש עוד תובנה מכניסטית. בזמן דלקת-induced ADM היא הפיכה2, oncogenic מוטציות קראס , אשר נמצאים ב- 90% של סרטן הלבלב המקרים3, למנוע בידול חזרה פנוטיפ acinar4,5, 6. Culturing, המבדילים תאים acinar הראשית לתוך תאי ductal בתרבות 3D מאפשר לימוד של המנגנונים המולקולריים המסדיר את תהליך ה-ADM, מה שקשה ללמוד ויוו. כגון ex-vivo מחקרים מאפשרים בזמן אמת להדמיה של ADM, מנהלי ההתקנים, הרגולטורים שלה. מספר מנהלי התקנים של תהליך ה-ADM, כמו גם תובנה מכניסטית על איתות המסלולים במורד הזרם שלהם, זוהו או מאומת באמצעות הכאן תיאר שיטה. אלה כוללים ADM אינדוקציה על ידי TGF-α (הפיכת גורם הגדילה אלפא)-מתווכת ביטוי של MMP-7 (מטריקס מטאלו-פרוטאינאז-7) והפעלה של דרגה7, כמו גם RANTES (מווסתות על ההפעלה, נורמלי תא T הביע והוא מופרש; גם ידוע כימוקין ליגנד 5 או CCL5) ו TNFα (גידול נקרוזה מקדם אלפא)-induced ADM באמצעות הפעלה של NF-κB (גרעיני גורם-κB)8. מתווך נוסף של ה-ADM הוא oncogenic קראס9,10, מה שגורם לעלייה סטרס חמצוני זה משפר את תהליך ה-ADM דרך ביטוי מוגבר של EGFR (קולטן גורם הגדילה באפידרמיס) ו שלה ליגנדים, EGF ( גורם הגדילה באפידרמיס) ו- TGF-α11.
בעוד השימוש שורות תאים סרטן הלבלב היא נפוצה עבור מחקרים במבחנה, תרביות תאים ראשי מציעים יתרונות רבים. למשל, ראשי תאים acinar העכברים הטרנסגניים-שאינם או עכברים מחסה מוטציות ייזום, כגון קראסG12D, הם המודל המתאים ביותר עבור לומד האירוע מוקדם של ADM כי התאים יש מוטציות כמה ומבוקר, אשר ידועים להיות נוכח בשלב מוקדם של התפתחות סרטן הלבלב. זאת לעומת זאת רבים שורות תאים סרטן הלבלב אשר יש מוטציות רבות מגוונות הביטוי מבוסס על המעבר מספר12. בנוסף, איתות המסלולים המזוהה על-ידי באמצעים אלה אומתו על ידי מחקרים שנעשו בבעלי חיים. קודם השימוש תאים acinar העיקרית היא כי הם לא יכולים transfected שיותר שורות תאים סרטן טיפוסי.
השיטה בזאת פירוט הטכניקות של בידוד תא acinar, תרבות 3D המחקה ADM על-ידי הוספת חומרים ממריצים או להתכוונן ביטוי חלבון באמצעות זיהום adenoviral או lentiviral, כמו גם בידוד מחדש של תאים על נקודת הקצה עבור ניתוחים נוספים.
Protocol
Representative Results
Discussion
כמות הזמן בידוד, זיהום של ציפוי ראשי תאים acinar קצר יחסית היא יתרון של שיטה זו. לעומת זאת, culturing תאים acinar תוצר explant דורשת מעט זמן על הידיים, אך לוקח שבעה ימים בשביל תוצר של תאים acinar13. פרוטוקול חלופי עבור בידוד acinar14 הערות שירות קצר מאוד להשגת תאים acinar; עם זאת, EGF היא מרכיב …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק R01 (CA200572) מ- NIH כדי PS. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים הרשמי של המכון הלאומי לסרטן או מוסדות לאומיים של Health.The והנושא היה אין תפקיד ללמוד עיצוב, איסוף נתונים, ניתוח, ההחלטה פרסום, או הכנה של כתב היד.
Materials
| 37 °C shaking incubator | Thermo Scientific | SHKE4000-7 | |
| 5% CO2, 37 °C Incubator | NUAIRE | NU-5500 | |
| 50 ml tubes | Falcon | 352070 | |
| Absorbent pad, 20" x 24" | Fisherbrand | 1420662 | |
| Adenovirus, Ad-GFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Aluminum foil | Fisherbrand | 01-213-101 | |
| BD Precision Glide Needle 21G x 1/2 | Fisher Scientific | 305167 | Use as pins for dissection |
| Beaker, 600 mL | Fisherbrand | FB-101-600 | |
| Bleach, 8.25% | Clorox | 31009 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Referred to as 'basement membrane matrix recovery solution' in the manuscript. |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-15R Centrifuge | |
| Collagenase Type I, Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | Create a 100 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water. When thawing one aliquot, dilute to 10 mg/ml, filter sterilize and place 1 ml aliquots at -20 °C. |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | Create a 4 mg/ml solution by dissolving powder in methanol, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Ethanol, 200 proof | Decon Laboratories | 2701 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926-100mL | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91127-12 | |
| Glass slide, 8-well | Lab-Tek | 177402 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), No calcium, No magnesium, No phenol red | Fisher Scientific | SH3048801 | |
| Ice bucket, rectangular | Fisher Scientific | 07-210-103 | |
| Instant Sealing Sterilization Pouch | Fisherbrand | 01-812-51 | |
| LAB GUARD specimen bags (for mouse after dissection) | Minigrip | SBL2X69S | |
| Lentiviral Packaging Mix, Virapower | Invitrogen | 44-2050 | |
| Matrigel | Corning | 356234 | Referred to as 'basement membrane matrix' in the manuscript. |
| Parafilm | Bemis | PM992 | Referred to as 'plastic paraffin film' in the manuscript. |
| PBS | Fisher Scientific | SH30028.02 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Pipet tips, 10 µl | USA Scientific | 1110-3700 | |
| Pipet tips, 1000 µl | Olympus Plastics | 24-165RL | |
| Pipet tips, 200 µl | USA Scientific | 1111-1700 | |
| Pipet-Aid | Drummond | ||
| PIPETMAN Classic P10, 1-10 μl | Gilson | F144802 | |
| PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 μl | Gilson | F123602 | |
| PIPETMAN Classic P20, 2-20 μl | Gilson | F123600 | |
| PIPETMAN Classic P200, 20-200 μl | Gilson | F123601 | |
| Pipettes, 10 ml | Falcon | 357551 | |
| Pipettes, 25 ml | Falcon | 357525 | |
| Pipettes, 5 ml | Falcon | 357543 | |
| Plate, 12-well | Corning Costar | 3513 | |
| Plate, 24-well plate | Corning Costar | 3524 | |
| Plate, 35 mm | Falcon | 353001 | |
| Plate, 6-well | Falcon | 353046 | |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003-G | Create a 40 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Polypropylene Mesh, 105 µm | Spectrum Labs | 146436 | |
| Polypropylene Mesh, 500 µm | Spectrum Labs | 146418 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14568-12 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Sodium Bicarbonate (Fine White Powder) | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 8 | Gibco | 17075029 | |
| Spatula | Fisherbrand | 21-401-10 | |
| Steriflip 50 ml, 0.22 micron filters | Millipore | SCGP00525 | |
| TGF-α | R&D Systems | 239-A-100 | |
| Type I Rat Tail Collagen | Corning | 354236 | |
| Waymouth MB 752/1 Medium (powder) | Sigma | W1625-10X1L | |
| Weigh boat, hexagonal, medium | Fisherbrand | 02-202-101 |
References
- Rooman, I., Real, F. X. Pancreatic ductal adenocarcinoma and acinar cells: a matter of differentiation and development. Gut. 61 (3), 449-458 (2012).
- Stanger, B. Z., Hebrok, M. Control of cell identity in pancreas development and regeneration. Gastroenterology. 144 (6), 1170-1179 (2013).
- Caldas, C., Kern, S. E. K-ras mutation and pancreatic adenocarcinoma. International Journal of Pancreatology. 18 (1), 1-6 (1995).
- Kopp, J. L., et al. Identification of Sox9-dependent acinar-to-ductal reprogramming as the principal mechanism for initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 22 (6), 737-750 (2012).
- Morris, J. P. t., Cano, D. A., Sekine, S., Wang, S. C., Hebrok, M. Beta-catenin blocks Kras-dependent reprogramming of acini into pancreatic cancer precursor lesions in mice. Journal of Clinical Investigation. 120 (2), 508-520 (2010).
- Grippo, P. J., Nowlin, P. S., Demeure, M. J., Longnecker, D. S., Sandgren, E. P. Preinvasive pancreatic neoplasia of ductal phenotype induced by acinar cell targeting of mutant Kras in transgenic mice. Cancer Research. 63 (9), 2016-2019 (2003).
- Sawey, E. T., Johnson, J. A., Crawford, H. C. Matrix metalloproteinase 7 controls pancreatic acinar cell transdifferentiation by activating the Notch signaling pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19327-19332 (2007).
- Liou, G. Y., et al. Macrophage-secreted cytokines drive pancreatic acinar-to-ductal metaplasia through NF-kappaB and MMPs. Journal of Cell Biology. 202 (3), 563-577 (2013).
- De La, O. J., et al. Notch and Kras reprogram pancreatic acinar cells to ductal intraepithelial neoplasia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18907-18912 (2008).
- Habbe, N., et al. Spontaneous induction of murine pancreatic intraepithelial neoplasia (mPanIN) by acinar cell targeting of oncogenic Kras in adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18913-18918 (2008).
- Liou, G. Y., et al. Mutant KRas-Induced Mitochondrial Oxidative Stress in Acinar Cells Upregulates EGFR Signaling to Drive Formation of Pancreatic Precancerous Lesions. Cell Report. 14 (10), 2325-2336 (2016).
- Hughes, P., Marshall, D., Reid, Y., Parkes, H., Gelber, C. The costs of using unauthenticated, over-passaged cell lines: how much more data do we need. Biotechniques. 43 (5), 577-578 (2007).
- Blauer, M., Nordback, I., Sand, J., Laukkarinen, J. A novel explant outgrowth culture model for mouse pancreatic acinar cells with long-term maintenance of secretory phenotype. European Journal of Cell Biology. 90 (12), 1052-1060 (2011).
- Gout, J., et al. Isolation and culture of mouse primary pancreatic acinar cells. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging cells in three-dimensional collagen matrix. Current Protocols in Cell Biology. , 11-20 (2010).
- Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. Revealing the cytoskeletal organization of invasive cancer cells in 3D. Journal of Visualized Experiments. (80), e50763 (2013).
