Taklit ve 3 boyutlu hücre kültüründe pankreas Acinar-için-duktal metaplazi manipüle
Summary
Birincil acinar hücre izolasyon, protein ifade veya etkinlik modülasyon, kültür ve aşağı akış uygulamaları eski bol yararlı vivo çalışmada acinar-için-duktal metaplazi (ADM), pankreas kanseri gelişimi erken bir durumda.
Abstract
Duktal hücreler acinar hücrelere farklılaşma pankreatit sırasında ve pankreas kanseri erken gelişiminde daha fazla çalışma gerektirir anahtar bir süreçtir. Düzenleyen acinar-için-duktal metaplazi (ADM), ex vivo 3D kültür ve duktal hücreler birincil acinar hücrelere farklılaşma mekanizmaları anlamak için diğer sistemleri birçok avantaj sunar. İle burada, modülasyon protein ifade basit ve hızlı, ayırma, teşvik veya virally bulaştırmak ve ADM sürecini araştırmak için birincil acinar hücre kültürü çalışmalarının başlaması için sadece bir gün gerektiren bir tekniktir. Tohum kollajen acinar hücre kümelerinin ben hücre dışı matriks, membran matrisi kullanarak aksine manipülasyon önce acinar kimliklerini korumak acinar hücreleri sağlar. Bu adm indüksiyon için çeşitli bileşenleri katkısını sınarken önemlidir Sadece etkileri sitokinler veya ectopically yönetilen diğer faktörler bu tekniği ile test edilebilir, ancak ortak mutasyonlar, artan protein ifade veya nakavt protein ifade viral enfeksiyon test edilebilir birincil acinar hücreleri kullanarak Adenoviral veya lentiviral vektörel çizimler. Ayrıca, hücreleri kollajen veya membran matris uç noktada yeniden ayrılmış olabilir ve protein ifade için analiz edilebilir.
Introduction
Acinar duktal metaplazi (ADM) pankreatit ve bir anahtar oluşum daha fazla mekanik kavrama gerektirir pankreas kanseri geliştirme1 sürüş sırasında koruyucu bir mekanizmadır. İltihap kaynaklı ADM tersinir2olmakla birlikte, pankreas kanseri durumlarda%390 mevcut, oncogenic KRAS mutasyonlar farklılaşma başa bir acinar fenotip4,5, önlemek 6. Culturing ve 3D kültür duktal hücre içine birincil acinar hücreleri ayırt sağlar içinde vivo çalışma zordur ADM süreci düzenleyen moleküler mekanizmaları çalışma için. Böyle ex vivo çalışmalar ADM, sürücülerinin ve onun regülatörleri gerçek zamanlı görselleştirme etkinleştirin. Çeşitli sürücüleri Mekanik kavrama üstünde onların aşağı akım sinyal yolları yanı sıra ADM işlemi tanımladığınızda veya doğrulanmış burada kullanarak yöntemi açıklanır. Bu ADM indüksiyon TGF-α (dönüştürme büyüme faktörü alfa) tarafından içerir-ifade MMP-7 (matriks metalloproteinaz-7) ve çentik7, hem de RANTES (harekete geçirmek üstünde normal T ifade ve salgılanan; Ayrıca bilinen hücre düzenlenir aktivasyonu aracılı kemokin ligand 5 veya CCL5) olarak ve TNFα (tümör nekrozis faktör alfa)-ADM NF-κB (nükleer faktör-κB)8aktivasyonu ile indüklenen. ADM ek bir arabulucu artırır artan ifade EGFR (epidermal büyüme faktörü reseptörü) ADM sürecinde ve ligandlar, EGF (oksidatif stres bir artış neden oncogenic KRas9,10, bu Epidermal büyüme faktörü) ve TGF-α11.
Pankreas kanseri hücre hatları kullanımı için tüp bebek çalışmalar ortak olmakla birlikte, birincil hücre kültürleri birçok avantaj sunar. Örneğin, birincil acinar sigara transgenik fareler veya KrasG12Dgibi Başlatan mutasyonlar yataklık fareler hücreleri kaç ve kontrollü mutasyonlar, çünkü ADM erken olay eğitim için en uygun modeli hücrelerdir hangi erken pankreas kanseri gelişiminde mevcut olduğu bilinmektedir. Buna ek olarak birden çok mutasyonlar var birçok pankreas kanseri hücre satırlar için bu ve çeşitli geçiş sayı12tarihinde temel ifade. Ayrıca, bu tür yöntemlerle tespit sinyal yolları hayvan çalışmaları tarafından doğrulanmıştır. Birincil acinar hücreleri kullanarak bir uyarı tipik kanser hücre hatları gibi onlar transfected değil mi.
Burada yöntemi acinar hücre izolasyon, ADM uyarıcılar ekleyerek veya protein ifade yolu ile adenoviral ya da lentiviral hastalık, hem hem daha fazla analizleri için uç noktada hücrelerinin yeniden yalıtım oransal taklit eden 3D kültür teknikleri ayrıntıları.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yalıtım, enfeksiyon ve birincil acinar hücreleri kaplama için nispeten kısa süreyi bu yöntemin bir avantajı var. Buna ek olarak, bir explant sonucu acinar hücrelerden kültür küçük eller zaman gerektirir, ama acinar hücreleri13akıbet için yedi gün alır. Acinar yalıtım14 için alternatif bir protokol acinar hücreleri elde etmek için çok kısa bir yöntem notları; Ancak, EGF acinar hücreleri hayatta ne zaman o protokolü kullanılarak izole tutmak ön…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser PS NIH R01 grant (CA200572) tarafından desteklenen İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Kanser Enstitüsü resmi görüşlerini temsil etmez veya tasarım, veri toplama ve analizi, karar için fon herhangi bir rolü yoktu Health.The ulusal kurumları çalışma yayımlamak, veya hazırlık şekilde alt alta yazılmalıdır.
Materials
| 37 °C shaking incubator | Thermo Scientific | SHKE4000-7 | |
| 5% CO2, 37 °C Incubator | NUAIRE | NU-5500 | |
| 50 ml tubes | Falcon | 352070 | |
| Absorbent pad, 20" x 24" | Fisherbrand | 1420662 | |
| Adenovirus, Ad-GFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Aluminum foil | Fisherbrand | 01-213-101 | |
| BD Precision Glide Needle 21G x 1/2 | Fisher Scientific | 305167 | Use as pins for dissection |
| Beaker, 600 mL | Fisherbrand | FB-101-600 | |
| Bleach, 8.25% | Clorox | 31009 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Referred to as 'basement membrane matrix recovery solution' in the manuscript. |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-15R Centrifuge | |
| Collagenase Type I, Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | Create a 100 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water. When thawing one aliquot, dilute to 10 mg/ml, filter sterilize and place 1 ml aliquots at -20 °C. |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | Create a 4 mg/ml solution by dissolving powder in methanol, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Ethanol, 200 proof | Decon Laboratories | 2701 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926-100mL | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91127-12 | |
| Glass slide, 8-well | Lab-Tek | 177402 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), No calcium, No magnesium, No phenol red | Fisher Scientific | SH3048801 | |
| Ice bucket, rectangular | Fisher Scientific | 07-210-103 | |
| Instant Sealing Sterilization Pouch | Fisherbrand | 01-812-51 | |
| LAB GUARD specimen bags (for mouse after dissection) | Minigrip | SBL2X69S | |
| Lentiviral Packaging Mix, Virapower | Invitrogen | 44-2050 | |
| Matrigel | Corning | 356234 | Referred to as 'basement membrane matrix' in the manuscript. |
| Parafilm | Bemis | PM992 | Referred to as 'plastic paraffin film' in the manuscript. |
| PBS | Fisher Scientific | SH30028.02 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Pipet tips, 10 µl | USA Scientific | 1110-3700 | |
| Pipet tips, 1000 µl | Olympus Plastics | 24-165RL | |
| Pipet tips, 200 µl | USA Scientific | 1111-1700 | |
| Pipet-Aid | Drummond | ||
| PIPETMAN Classic P10, 1-10 μl | Gilson | F144802 | |
| PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 μl | Gilson | F123602 | |
| PIPETMAN Classic P20, 2-20 μl | Gilson | F123600 | |
| PIPETMAN Classic P200, 20-200 μl | Gilson | F123601 | |
| Pipettes, 10 ml | Falcon | 357551 | |
| Pipettes, 25 ml | Falcon | 357525 | |
| Pipettes, 5 ml | Falcon | 357543 | |
| Plate, 12-well | Corning Costar | 3513 | |
| Plate, 24-well plate | Corning Costar | 3524 | |
| Plate, 35 mm | Falcon | 353001 | |
| Plate, 6-well | Falcon | 353046 | |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003-G | Create a 40 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Polypropylene Mesh, 105 µm | Spectrum Labs | 146436 | |
| Polypropylene Mesh, 500 µm | Spectrum Labs | 146418 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14568-12 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Sodium Bicarbonate (Fine White Powder) | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 8 | Gibco | 17075029 | |
| Spatula | Fisherbrand | 21-401-10 | |
| Steriflip 50 ml, 0.22 micron filters | Millipore | SCGP00525 | |
| TGF-α | R&D Systems | 239-A-100 | |
| Type I Rat Tail Collagen | Corning | 354236 | |
| Waymouth MB 752/1 Medium (powder) | Sigma | W1625-10X1L | |
| Weigh boat, hexagonal, medium | Fisherbrand | 02-202-101 |
References
- Rooman, I., Real, F. X. Pancreatic ductal adenocarcinoma and acinar cells: a matter of differentiation and development. Gut. 61 (3), 449-458 (2012).
- Stanger, B. Z., Hebrok, M. Control of cell identity in pancreas development and regeneration. Gastroenterology. 144 (6), 1170-1179 (2013).
- Caldas, C., Kern, S. E. K-ras mutation and pancreatic adenocarcinoma. International Journal of Pancreatology. 18 (1), 1-6 (1995).
- Kopp, J. L., et al. Identification of Sox9-dependent acinar-to-ductal reprogramming as the principal mechanism for initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 22 (6), 737-750 (2012).
- Morris, J. P. t., Cano, D. A., Sekine, S., Wang, S. C., Hebrok, M. Beta-catenin blocks Kras-dependent reprogramming of acini into pancreatic cancer precursor lesions in mice. Journal of Clinical Investigation. 120 (2), 508-520 (2010).
- Grippo, P. J., Nowlin, P. S., Demeure, M. J., Longnecker, D. S., Sandgren, E. P. Preinvasive pancreatic neoplasia of ductal phenotype induced by acinar cell targeting of mutant Kras in transgenic mice. Cancer Research. 63 (9), 2016-2019 (2003).
- Sawey, E. T., Johnson, J. A., Crawford, H. C. Matrix metalloproteinase 7 controls pancreatic acinar cell transdifferentiation by activating the Notch signaling pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19327-19332 (2007).
- Liou, G. Y., et al. Macrophage-secreted cytokines drive pancreatic acinar-to-ductal metaplasia through NF-kappaB and MMPs. Journal of Cell Biology. 202 (3), 563-577 (2013).
- De La, O. J., et al. Notch and Kras reprogram pancreatic acinar cells to ductal intraepithelial neoplasia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18907-18912 (2008).
- Habbe, N., et al. Spontaneous induction of murine pancreatic intraepithelial neoplasia (mPanIN) by acinar cell targeting of oncogenic Kras in adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18913-18918 (2008).
- Liou, G. Y., et al. Mutant KRas-Induced Mitochondrial Oxidative Stress in Acinar Cells Upregulates EGFR Signaling to Drive Formation of Pancreatic Precancerous Lesions. Cell Report. 14 (10), 2325-2336 (2016).
- Hughes, P., Marshall, D., Reid, Y., Parkes, H., Gelber, C. The costs of using unauthenticated, over-passaged cell lines: how much more data do we need. Biotechniques. 43 (5), 577-578 (2007).
- Blauer, M., Nordback, I., Sand, J., Laukkarinen, J. A novel explant outgrowth culture model for mouse pancreatic acinar cells with long-term maintenance of secretory phenotype. European Journal of Cell Biology. 90 (12), 1052-1060 (2011).
- Gout, J., et al. Isolation and culture of mouse primary pancreatic acinar cells. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging cells in three-dimensional collagen matrix. Current Protocols in Cell Biology. , 11-20 (2010).
- Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. Revealing the cytoskeletal organization of invasive cancer cells in 3D. Journal of Visualized Experiments. (80), e50763 (2013).
