Visualizzazione fluorescente dell'RNA marcato al mango nei gel di poliacrilofofora tramite un metodo poststaino
Summary
Qui presentiamo un metodo sensibile, rapido e discriminante di colorazione post-gel per immagini di RNA etichettati con aptamers RNA Mango I, II, III o IV, utilizzando gel nativi o denacilidi di gel poliacrilamina (PAGE). Dopo aver eseguito gel PAGE standard, l’RNA con etichettatura mango può essere facilmente macchiato con TO1-Biotin e quindi analizzato utilizzando lettori di fluorescenza comunemente disponibili.
Abstract
I gel ponopazienti e denaclari poliacrilamide sono regolarmente utilizzati per caratterizzare la mobilità complessa della ribonucleoproteina (RNP) e per misurare rispettivamente la dimensione dell’RNA. Poiché molte tecniche di imaging gel utilizzano macchie non specifiche o costose sonde fluoroforo, sono altamente desiderabili metodologie sensibili, discriminanti ed economiche per l’imaging del gel. Le sequenze centrali di RNA Mango sono piccoli motivi di sequenza (19-22 nt) che, se chiusi da un gambo arbitrario dell’RNA, possono essere aggiunti in modo semplice ed economico a un RNA di interesse. Questi tag Mango si legano con un’alta affinità e specificità a un ligando fluoroforo tiazole-arancio chiamato TO1-Biotin, che diventa migliaia di volte più fluorescente dopo il legame. Qui mostriamo che Mango I, II, III e IV possono essere usati per immagini specifiche di RNA in gel ad alta sensibilità. Fino a 62,5 fmol di RNA nei gel nativi e 125 fmol di RNA nei gel denatura possono essere rilevati da gel imbecilli in un buffer di imaging contenente potassio e 20 nM TO1-Biotin per 30 min. Dimostriamo la specificità del sistema con etichettatura mango mediante l’imaging di un RNA batterico 6S etichettato con mango nel contesto di una complessa miscela di RNA batterico totale.
Introduction
Il mango è un sistema di etichettatura dell’RNA costituito da un insieme di quattro piccoli aptamer fluorescenti RNA che si legano strettamente (rilegamento nanomolare) a semplici derivati del tiazolo-arancione (TO1-Biotin, Figura 1A)1,2,3 . Al momento del legame, la fluorescenza di questo ligando viene aumentata da 1.000 a 4.000 volte a seconda dell’aptamero specifico. L’elevata luminosità del sistema Mango, che per Mango III supera quella della proteina fluorescente verde potenziata (eGFP), combinata con l’affinità di legame nanomolare degli aptamori RNA Mango, lo permette di essere utilizzato sia nell’imaging che nella purificazione dell’RNA complessi2,4.
Le strutture a raggi X di Mango I5, II6e III7 sono state determinate ad alta risoluzione, e tutti e tre i pulsanti utilizzano un quadruplex di RNA per legare TO1-Biotin (Figura 1B–D). I nuclei compatti di tutti e tre gli aptamers sono isolati dalla sequenza esterna dell’RNA tramite motivi di adattatore compatto. Mango I e II utilizzano entrambi un adattatore di loop flessibile simile a GNRA per collegare i loro nuclei di Mango a un duplex DI RNA arbitrario (Figura 1B, C). Al contrario, Mango III utilizza un motivo triplex rigido per collegare il suo nucleo a un’elica arbitraria dell’RNA (Figura 1D, residui viola), mentre la struttura di Mango IV non è attualmente nota. Poiché il nucleo legante del ligando di ciascuno di questi aptamers è separato dalla sequenza esterna di RNA da questi adattatori elicoidali, sembra probabile che tutti possano essere semplicemente incorporati in una varietà di RNA. L’RNA regolatore 6S batterico (Mango I), i componenti del lievito spicchio (Mango I), e l’RNA umano 5S, U6 RNA, e uno scaRNA C/D (Mango II e IV) sono stati tutti etichettati con successo in questo modo2,8, suggerendo che molti gli RNA biologici possono essere etichettati utilizzando il sistema di aptameri RNA Mango.
Denatura e gel nativi sono comunemente utilizzati per studiare gli RNA. I gel di denatura sono spesso usati per giudicare la dimensione dell’RNA o l’elaborazione dell’RNA, ma in genere, nel caso di una macchia settentrionale, ad esempio, richiedono diversi passaggi lenti e sequenziali per generare un’immagine. Mentre altri aptameri fluorogeni dell’RNA, come RNA Spinach e Broccoli, sono stati utilizzati con successo per l’imaging in gel9, nessun sistema di aptameri fluorogenico fino ad oggi possiede l’elevata luminosità e affinità del sistema Mango, rendendolo di notevole interesse per studiare le capacità di imaging gel di Mango. In questo studio, ci siamo chiesti se il sistema RNA Mango potesse essere semplicemente esteso all’imaging gel, poiché le lunghezze d’onda di eccitazione ed emissione di TO1-Biotin (510 nm e 535 nm, rispettivamente) sono appropriate per l’imaging nel canale eGFP comune alla maggior parte fluorescente strumentazione di scansione gel.
Il protocollo di colorazione post-gel qui presentato fornisce un modo rapido per rilevare specificamente le molecole di RNA etichettate con mango nei gel nativi e denatura del gel poliacrilammide (PAGE). Questo metodo di colorazione prevede gel di ammollo in un buffer contenente potassio e TO1-Biotina. Gli aptamers RNA Mango sono a base di G-quadruplex e il potassio è necessario per stabilizzare tali strutture. Utilizzando l’RNA trascritto da modelli minimi di DNA che codificano mango (vedi la sezione del protocollo), possiamo semplicemente rilevare appena 62,5 fmol di RNA nei gel nativi e 125 fmol di RNA nei gel di denatura, utilizzando un protocollo di colorazione semplice. A differenza delle comuni macchie di acido nucleico non specifico (vedi Tabella dei materiali, riferite a SG da qui), possiamo identificare chiaramente l’RNA affettato dal mango anche quando nel campione sono presenti alte concentrazioni di RNA totale senza tag.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un vantaggio significativo del tag fluorescente Mango è che un singolo tag può essere utilizzato in più modi. L’elevata luminosità e affinità di questi aptamers li rendono utili non solo per la visualizzazione cellulare 2, ma anche per l’RNA in vitro o la purificazione rnP4. Pertanto, l’imaging gel estende la versatilità del tag Mango in modo semplice. La sensibilità all’imaging del gel di mango è leggermente inferiore a quella di una macchia settentrionale<sup clas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Razvan Cojocaru e Amir Abdolahzadeh per la loro assistenza tecnica e Lena Dolgosheina per la revisione del manoscritto. Il finanziamento è stato fornito per questo progetto da una sovvenzione operativa del Canadian Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) a P.J.U.
Materials
| 0.8mm Thick Comb 14 Wells for 30 mL PAGE gels | LabRepCo | 11956042 | |
| 101-1000 µL tips | Fisher | 02-707-511 | |
| 20-200 µL low retention tips | Fisher Scientific | 02-717-143 | |
| Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 19:1) | Bioreagents | BP1406-1 | Acute toxicity |
| Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 29:1) | Fisher | BP1408-1 | Acute toxicity |
| Agar | Anachemia | 02116-380 | |
| Aluminium backed TLC plate | Sigma-Aldrich | 1164840001 | |
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Lifesciences | 29083461 | |
| Ammonium Persulfate | Biorad | 161-0700 | Harmful |
| BL21 cells | NEB | C2527H | |
| Boric Acid | ACP | B-2940 | |
| Bromophenol Blue sodium salt | Sigma | B8026-25G | |
| Chloloform | ACP | C3300 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich Alcohols | D0632-5G | |
| DNase I | ThermoFisher | EN0525 | |
| EDTA Disodium Salt | ACP | E-4320 | |
| Ethanol | Commerial | P016EAAN | |
| Flat Gel Loading tips | Costar | CS004854 | |
| Formamide 99% | Alfa Aesar | A11076 | |
| Gel apparatus set with spacers and combs | LabRepCo | 41077017 | |
| Glass Dish with Plastic lid | Pyrex | 1122963 | Should be large enough to fit your gel piece |
| Glycerol | Anachemia | 43567-540 | |
| HCl | Anachemia | 464140468 | |
| ImageQuanTL | GE Healthcare Lifesciences | 29000605 | |
| IPTG | Invitrogen | 15529-019 | |
| KCl | ACP | P-2940 | |
| MgCl2 | Caledron | 4903-01 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M3409 | |
| NaCl | ACP | S-2830 | |
| NaOH | BDH | BDH9292 | |
| Orbital Rotator | Lab-Line | ||
| Phenol | Invitrogen | 15513-039 | |
| Round Gel Loading tips | Costar | CS004853 | |
| Sodium Phosphate dibasic | Caledron | 8120-1 | |
| Sodium Phosphate monobasic | Caledron | 8180-01 | |
| SYBRGold | ThermoFisher | S11494 | |
| T7 RNA Polymerase | ABM | E041 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T7024-50 ml | |
| TO1-3PEG-Biotin Fluorophore | ABM | G955 | |
| Tris Base | Fisher | BP152-500 | |
| Tryptone | Fisher | BP1421-500 | |
| Tween-20 | Sigma | P9496-100 | |
| Urea | Fisher | U15-3 | |
| Xylene Cyanol | Sigma | X4126-10G | |
| Yeast Extract | Bioshop | YEX401.500 |
References
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