Summary

ポスト染色法によるポリアクリルアミドゲル中のマンゴータグRNAの蛍光可視化

Published: June 21, 2019
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Summary

ここでは、RNAマンゴーアプタマーI、II、III、またはIVでタグ付けされたRNAを画像化する敏感で迅速かつ判別的なポストゲル染色法を、天然または未消化ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)ゲルを用いて提示する。標準的なPAGEゲルを実行した後、マンゴータグ付きRNAはTO1-Biotinで容易に染色し、一般的に利用可能な蛍光リーダーを使用して分析することができます。

Abstract

天然および変性ポリアクリルアミドゲルは、リボヌクレオプロテイン(RNP)複合体移動性を特徴付け、それぞれRNAサイズを測定するために日常的に使用されます。多くのゲルイメージング技術は、非特異的な染色や高価な蛍光色素プローブを使用するため、敏感、判別、および経済的なゲルイメージング方法論が非常に望ましい。RNAマンゴーコア配列は、任意のRNAステムによって閉じた場合、単にかつ安価に目的とするRNAに付加することができる小さな(19-22 nt)配列モチーフである。これらのマンゴータグは、TO1-Biotinと呼ばれるチアゾールオレンジ蛍光リガンドに高い親和性と特異性を結合し、結合時に数千倍の蛍光になります。ここで、マンゴーI、II、III、およびIVは、高感度のゲル中のRNAを特異的に画像化するために使用できることを示す。天然ゲル中のRNAの62.5 fmolと、入型ゲル中のRNAの125 fmolは、カリウムを含む画像バッファーにゲルを浸漬し、20nM TO1-Biotinを30分間検出することができる。マンゴータグ付き6S細菌RNAを、全細菌RNAの複雑な混合物のコンテキストでイメージングすることにより、マンゴータグ付きシステムの特異性を実証する。

Introduction

マンゴーは、チアゾールオレンジ(TO1-Biotin、図1A)1、2、3の単純な誘導体に密結合する4つの小さな蛍光RNAアプタマーのセットからなるRNAタグ付けシステムです。.結合すると、このリガンドの蛍光は、特定のアプタマーに応じて1,000〜4,000倍に増加する。マンゴーIIIの高輝度は、強化された緑色蛍光タンパク質(eGFP)を超えるマンゴー系の高輝度と、RNAマンゴーアプタマーのナノモル結合親和性と組み合わせることで、RNAのイメージングと精製の両方に使用することができます。複合体2,4.

マンゴーI5、II6、およびIII7のX線構造は高分解能に決定されており、3つのアプタマーはすべてRNA四分円を利用してTO1-Biotin(図1B-D)を結合する。すべての3つのアプタマーの密集した中心は密集したアダプターのモチーフによって外的なRNA配列から隔離される。マンゴーIとIIは、柔軟なGNRAのようなループアダプタを使用して、マンゴーコアを任意のRNAデュプレックスに接続します(図1B,C)。対照的に、マンゴーIIIは、そのコアを任意のRNAらせん(図1D、紫色の残渣)に接続するために剛性トリプレックスモチーフを使用していますが、マンゴーIVの構造は現在知られていません。これらのアプタマーのリガンド結合コアは、これらのヘリカルアダプターによって外部RNA配列から分離されるので、それらはすべて単に様々なRNAに組み込むことができる可能性が高い。細菌6S調節RNA(マンゴーI)、酵母スプリセオソーム(マンゴーI)の成分、およびヒト5S RNA、U6 RNA、およびC/D scaRNA(マンゴーIIおよびIV)はすべて、この方法でうまくタグ付けされている2、8、多くであることを示唆している生物学的RNAは、RNAマンゴーアプタマー系を使用してタグ付けすることができます。

RNAの研究には、未生および天然ゲルが一般的に使用されます。転移ゲルは、RNAサイズまたはRNA処理を判断するためによく使用されますが、典型的には、北部のブロットの場合、例えば、画像を生成するためにいくつかの遅い、逐次的なステップを必要とします。RNAホウレンソウやブロッコリーなどの他のRNAフルオロゲンアプタマーはゲルイメージング9に成功していますが、これまでフルオロゲンアプタマー系はマンゴー系の高輝度と親和性を持たないため、かなりの関心を持っています。マンゴーのゲルイメージング能力を調べるために。本研究では、TO1-Biotin(それぞれ510nmおよび535nm)の励起波長がほとんどの蛍光に共通するeGFPチャネルでのイメージングに適しているので、RNAマンゴーシステムを単にゲルイメージングに拡張できるかどうか疑問に思いました。ゲルスキャンの器械使用。

ここで提示されるポストゲル染色プロトコルは、マンゴータグ付きRNA分子をネイティブおよび脱帰性ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)ゲルで特異的に検出する迅速な方法を提供します。この染色方法は、カリウムおよびTO1-Biotinを含む緩衝液にゲルを浸すことを含む。RNAマンゴーアプタマーはG-四重化基基であり、カリウムはそのような構造を安定化するために必要とされる。最小限のマンゴーコードDNAテンプレートから転写されたRNA(プロトコルセクションを参照)を使用して、単純な染色プロトコルを使用して、ネイティブゲル中のRNAの62.5 fmolと脱変性ゲル中のRNAの125 fmolをわずかしか検出できません。一般的な非特異的核酸染色とは対照的に(材料の表を参照)、サンプル中にタグ付けされていない全高濃度のRNAが存在する場合でも、マンゴータグ付きRNAを明確に同定することができます。

Protocol

1. 試薬の調製 TO1-ビオチンポスト染色液(ゲル染色液) Na2 HPO4の1Mの342 mLと1M NaH2 PO4の158mLを加えて25°CでpH 7.2で1Mリン酸バッファーの1Lを作る。適切なリン酸溶液を加えて50mMでpHを7.2に調整します。0.2 μmフィルターを使用した滅菌フィルターを使用し、溶液を室温でプラスチック製品に保存します。 5倍ゲル染色液(TO1-Biotinを除?…

Representative Results

短いマンゴータグ付きRNAは、プロトコルセクションで説明されているように調製されました。ゲル中の尿素の存在により、回帰条件での蛍光が最も観察しにくいと仮定し、まず核酸の脱窒剤として作用する尿素に対するマンゴーアプタマーの耐性を検討した。マンゴーアプタマーは、約1M(図2A)の尿素濃度までの脱彩に対して実質的に耐性があることがわ?…

Discussion

マンゴー蛍光タグの大きな利点は、1つのタグが複数の方法で使用できることです。これらのアプタマーの高輝度と親和性は、細胞可視化2だけでなく、インビトロRNAまたはRNP精製4にも有用です。従って、ゲルイメージ投射はマンゴーのタグの多様性を簡単な方法で拡張する。マンゴーゲルイメージング感度は、ノーザンブロット14のそれ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、ラズヴァン・コジョカルとアミール・アブドラザデの技術支援とレナ・ドルゴシーナに原稿を校正してくれたことに感謝している。このプロジェクトの資金は、カナダ自然科学工学研究協議会(NSERC)がP.J.Uに対する運営助成金によって提供されました。

Materials

0.8mm Thick Comb 14 Wells for 30 mL PAGE gels LabRepCo 11956042
101-1000 µL  tips Fisher 02-707-511
20-200 µL low retention  tips Fisher Scientific 02-717-143
Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 19:1) Bioreagents BP1406-1 Acute toxicity
Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 29:1) Fisher BP1408-1 Acute toxicity
Agar Anachemia 02116-380
Aluminium backed TLC plate Sigma-Aldrich 1164840001
Amersham Imager 600 GE Healthcare Lifesciences 29083461
Ammonium Persulfate Biorad 161-0700 Harmful
BL21 cells NEB C2527H
Boric Acid ACP B-2940
Bromophenol Blue sodium salt Sigma B8026-25G
Chloloform ACP C3300
Dithiothreitol Sigma Aldrich Alcohols D0632-5G
DNase I ThermoFisher EN0525
EDTA Disodium Salt ACP E-4320
Ethanol Commerial  P016EAAN
Flat Gel Loading tips Costar CS004854
Formamide 99% Alfa Aesar A11076
Gel apparatus set with spacers and combs LabRepCo 41077017
Glass Dish with Plastic lid Pyrex 1122963 Should be large enough to fit your gel piece
Glycerol Anachemia 43567-540
HCl Anachemia 464140468
ImageQuanTL GE Healthcare Lifesciences 29000605
IPTG Invitrogen 15529-019
KCl ACP P-2940
MgCl2 Caledron 4903-01
MgSO4 Sigma-Aldrich M3409
NaCl ACP S-2830
NaOH BDH BDH9292
Orbital Rotator Lab-Line
Phenol Invitrogen 15513-039
Round Gel Loading tips Costar CS004853
Sodium Phosphate dibasic Caledron 8120-1
Sodium Phosphate monobasic Caledron 8180-01
SYBRGold ThermoFisher S11494
T7 RNA Polymerase ABM E041
TEMED Sigma-Aldrich T7024-50 ml
TO1-3PEG-Biotin Fluorophore ABM G955
Tris Base Fisher BP152-500
Tryptone Fisher BP1421-500
Tween-20 Sigma P9496-100
Urea Fisher U15-3
Xylene Cyanol Sigma X4126-10G
Yeast Extract Bioshop YEX401.500

References

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Cite This Article
Yaseen, I. M., Ang, Q. R., Unrau, P. J. Fluorescent Visualization of Mango-tagged RNA in Polyacrylamide Gels via a Poststaining Method. J. Vis. Exp. (148), e59112, doi:10.3791/59112 (2019).

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