Summary

Флуоресцентная визуализация Манго помечены РНК в полиакриламида гели с помощью пост-стоиносидный метод

Published: June 21, 2019
doi:

Summary

Здесь мы представляем чувствительный, быстрый и дискриминационный пост-гель окрашивая метод изображения РНК помечены РНК Манго aptamers I, II, III, или IV, используя либо родной или денатурирующий полиакриламид гель электрофорез (PAGE) гели. После запуска стандартных гелей PAGE, Манго помечены РНК может быть легко окрашены с TO1-Biotin, а затем проанализированы с помощью широко доступных читателей флуоресценции.

Abstract

Родные и денатурные гели полиакриламидов обычно используются для характеристики подвижности рибонуклеопротеина (РНП) и для измерения размера РНК, соответственно. Как и многие методы гель-изображения использовать неспецифические пятна или дорогие фторроновые зонды, чувствительные, дискриминационные, и экономичный гель-изображений методологии являются весьма желательными. ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОсти ядра RNA Mango являются небольшими (19-22 nt) мотивами последовательности, которые, при закрытии произвольного стебля РНК, могут быть просто и недорого приложены к РНК интереса. Эти теги манго связываются с высокой близостью и специфичностью к тиазол-оранжевому флюорофору лиганду под названием TO1-Biotin, который становится в тысячи раз более флуоресцентным при связывании. Здесь мы показываем, что Манго I, II, III и IV могут быть использованы специально для изображения РНК в гели с высокой чувствительностью. Всего лишь 62,5 моль РНК в родных гелей и 125 моль РНК в денатурирующих гелей может быть обнаружена путем замачивания гелей в буфере изображения, содержащем калий и 20 нМ TO1-Биотина в течение 30 мин. Мы демонстрируем специфику манго-тегами системы путем визуализации манго помечены 6S бактериальной РНК в контексте сложной смеси общей бактериальной РНК.

Introduction

Манго представляет собой РНК пометки система, состоящая из набора из четырех небольших флуоресцентных РНК aptamers, которые связывают плотно (наномолярной связывания) к простым производным тиазол-оранжевый (TO1-Биотин, Рисунок 1A)1,2,3 . При связке флуоресценция этого лиганда увеличивается в 1000-4000 раз в зависимости от конкретного аптамера. Высокая яркость системы манго, которая для Манго III превышает уровень улучшенного зеленого флуоресцентного белка (eGFP), в сочетании с наномолярной связывающей сродством аптамеров РНК Манго, позволяет использовать ее как при визуализации, так и в очищении РНК комплексы2,4.

Рентгеновские структуры МангоI5, II6и III7 были определены с высоким разрешением, и все три аптамеров использовать РНК четырехугольник, чтобы связать TO1-Biotin (Рисунок 1B-D). Компактные ядра всех трех аптамеров изолированы от внешней последовательности РНК с помощью компактных адаптеров. Манго I и II оба используют гибкий GNRA-как петля адаптер для подключения их ядер манго к произвольной РНК дуплекс(Рисунок 1B, C). В отличие от этого, Mango III использует жесткий мотив триплекса, чтобы соединить его ядро с произвольной спиралью РНК(рисунок 1D,фиолетовые остатки), в то время как структура Манго IV в настоящее время не известна. Как лиганд-связывающее ядро каждого из этих aptamers отделен от внешней последовательности РНК этими сугнительными адаптерами, кажется вероятным, что все они могут быть просто включены в различные РНК. Бактериальная 6S регулятивная РНК (Манго I), компоненты дрожжевой spliceosome (Манго I), и человека 5S РНК, U6 РНК, и C / D scaRNA (Манго II и IV) все были успешно помечены таким образом2,8, предполагая, что многие многие биологические РНК могут быть помечены с помощью системы РНК Манго aptamer.

Денатуринг и местные гели обычно используются для изучения РНК. Денатуринг гели часто используются для судить размер РНК или РНК обработки, но, как правило, в случае северной пятно, например, требуют нескольких медленных и последовательных шагов для того, чтобы создать изображение. В то время как другие РНК фторгенных аптамеров, таких как РНК шпинат и брокколи, были успешно использованы для геля изображения9, не фторгенной аптамера системы на сегодняшний день не обладает высокой яркостью и сродством системы манго, что делает его значительный интерес для изучения манго гель-изображения способностей. В этом исследовании мы задавались вопросом, может ли система RNA Mango быть просто расширена до геля, так как возбуждение и длина волн выбросов TO1-Biotin (510 нм и 535 нм, соответственно) подходят для визуализации в канале eGFP, обычном для большинства флуоресцентных гелевосканно-сканирующие приборы.

Пост-гель окрашивания протокол, представленный здесь обеспечивает быстрый способ конкретно обнаружить Манго помечены молекулРНЫ в родной и denaturing полиакриламид гель электрофорез (PAGE) гели. Этот метод окрашивания включает в себя замачивания гелей в буфере, содержащем калий и TO1-Biotin. РНК Манго aptamers являются G-четверки основе и калий требуется для стабилизации таких структур. Используя РНК, транскрибированные из минимальных мангокодирующих шаблонов ДНК (см. раздел протокола), мы можем просто обнаружить всего лишь 62,5 фмоль РНК в местных гелей и 125 фмоль РНК в денатурации гелей, используя простой протокол окринирования. В отличие от обычных неспецифических ядерных кислотных пятен (см. ТаблицаМатериалов, упомянутых в SG от hereon), мы можем четко определить Манго помечены РНК, даже если высокие концентрации общего untagged РНК присутствуют в образце.

Protocol

1. Подготовка реагентов To1-Biotin постстогиврешение решение (гель окрашивающий раствор) Сделать 1 L 1 M фосфатного буфера на рН 7,2 на 25 градусов по Цельсию, добавив 342 мл 1 М Na2HPO4 и 158 мл 1 M2PO4. Отрегулируйте рН до 7,2 при 50 мМ, добавив соответствующий фосфа?…

Representative Results

Короткие Манго помечены РНК были подготовлены, как описано в разделе протокола. Предполагая, что флуоресценция в условиях денатурации будет наиболее трудно наблюдать из-за присутствия мочевины в гелях, мы впервые изучили устойчивость манго аптамеров к мочевину, кото?…

Discussion

Существенным преимуществом флуоресцентного тега Mango является то, что один тег может быть использован несколькими способами. Высокая яркость и сродство этих aptamers сделать их полезными не только в визуализации клеток 2, но и для in vitro РНК или RNP очистки4. Таким обра?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы благодарят Развана Кожокару и Амира Абдолахзаде за техническую помощь и Лену Долгошеину за коррективную прочтение рукописи. Финансирование этого проекта было предоставлено Канадским советом по естественным наукам и инженерным исследованиям (NSERC) в рамках оперативного гранта P.J.U.

Materials

0.8mm Thick Comb 14 Wells for 30 mL PAGE gels LabRepCo 11956042
101-1000 µL  tips Fisher 02-707-511
20-200 µL low retention  tips Fisher Scientific 02-717-143
Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 19:1) Bioreagents BP1406-1 Acute toxicity
Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 29:1) Fisher BP1408-1 Acute toxicity
Agar Anachemia 02116-380
Aluminium backed TLC plate Sigma-Aldrich 1164840001
Amersham Imager 600 GE Healthcare Lifesciences 29083461
Ammonium Persulfate Biorad 161-0700 Harmful
BL21 cells NEB C2527H
Boric Acid ACP B-2940
Bromophenol Blue sodium salt Sigma B8026-25G
Chloloform ACP C3300
Dithiothreitol Sigma Aldrich Alcohols D0632-5G
DNase I ThermoFisher EN0525
EDTA Disodium Salt ACP E-4320
Ethanol Commerial  P016EAAN
Flat Gel Loading tips Costar CS004854
Formamide 99% Alfa Aesar A11076
Gel apparatus set with spacers and combs LabRepCo 41077017
Glass Dish with Plastic lid Pyrex 1122963 Should be large enough to fit your gel piece
Glycerol Anachemia 43567-540
HCl Anachemia 464140468
ImageQuanTL GE Healthcare Lifesciences 29000605
IPTG Invitrogen 15529-019
KCl ACP P-2940
MgCl2 Caledron 4903-01
MgSO4 Sigma-Aldrich M3409
NaCl ACP S-2830
NaOH BDH BDH9292
Orbital Rotator Lab-Line
Phenol Invitrogen 15513-039
Round Gel Loading tips Costar CS004853
Sodium Phosphate dibasic Caledron 8120-1
Sodium Phosphate monobasic Caledron 8180-01
SYBRGold ThermoFisher S11494
T7 RNA Polymerase ABM E041
TEMED Sigma-Aldrich T7024-50 ml
TO1-3PEG-Biotin Fluorophore ABM G955
Tris Base Fisher BP152-500
Tryptone Fisher BP1421-500
Tween-20 Sigma P9496-100
Urea Fisher U15-3
Xylene Cyanol Sigma X4126-10G
Yeast Extract Bioshop YEX401.500

References

  1. Dolgosheina, E. V., et al. RNA Mango Aptamer-Fluorophore: A Bright, High-Affinity Complex for RNA Labeling and Tracking. ACS Chemical Biology. , (2014).
  2. Autour, A., et al. Fluorogenic RNA Mango aptamers for imaging small non-coding RNAs in mammalian cells. Nature Communications. 9, 656 (2018).
  3. Dolgosheina, E. V., Unrau, P. J. Fluorophore-binding RNA aptamers and their applications: Fluorophore-binding RNA aptamers. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2016).
  4. Panchapakesan, S. S., et al. Ribonucleoprotein Purification and Characterization using RNA Mango. RNA. , 1592-1599 (2017).
  5. Trachman, R. J., et al. Structural basis for high-affinity fluorophore binding and activation by RNA Mango. Nature Chemical Biology. 13, 807 (2017).
  6. Trachman, R. J., et al. Crystal Structures of the Mango-II RNA Aptamer Reveal Heterogeneous Fluorophore Binding and Guide Engineering of Variants with Improved Selectivity and Brightness. Biochemistry. 57, 3544-3548 (2018).
  7. Trachman, R., et al. Mango-III is a compact fluorogenic RNA aptamer of unusual structural complexity. Nature Chemical Biology. , (2018).
  8. Panchapakesan, S. S. S., Jeng, S. C. Y., Unrau, P. J. RNA complex purification using high-affinity fluorescent RNA aptamer tags. Annals of the New York Academy of Sciences. , (2015).
  9. Filonov, G. S., Kam, C. W., Song, W., Jaffrey, S. R. In-gel imaging of RNA processing using Broccoli reveals optimal aptamer expression strategies. Chemistry & Biology. 22, 649-660 (2015).
  10. Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).
  11. A Typical DNase I Reaction Protocol (M0303). NEB Available from: https://www.neb.com/protocols/1/01/01/a-typical-dnase-i-reaction-protocol-m0303 (2018)
  12. Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
  13. Tuma, R. S., et al. Characterization of SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain: A Dye Optimized for Use with 300-nm Ultraviolet Transilluminators. Analytical Biochemistry. 268, 278-288 (1999).
  14. Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Northern Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nature Protocols. 4, 37-43 (2009).
  15. Ebhardt, H. A., Unrau, P. J. Characterizing multiple exogenous and endogenous small RNA populations in parallel with subfemtomolar sensitivity using a streptavidin gel-shift assay. RNA. 15, 724-731 (2009).

Play Video

Cite This Article
Yaseen, I. M., Ang, Q. R., Unrau, P. J. Fluorescent Visualization of Mango-tagged RNA in Polyacrylamide Gels via a Poststaining Method. J. Vis. Exp. (148), e59112, doi:10.3791/59112 (2019).

View Video