यहां, हम आलू के पौधों को बदलने के लिए दो प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । एगरोबैक्टीरियम ट्यूमेफेशियन्स रूपांतरण एक पूर्ण ट्रांसजेनिक संयंत्र की ओर जाता है जबकि एगरोबैक्टीरियम rhizogenes एक जंगली प्रकार के शूट में ट्रांसजेनिक बालों की जड़ों का उत्पादन करता है जो आत्म प्रचारित किया जा सकता है । हम तो बदल जड़ों में धुंधला गस द्वारा प्रमोटर गतिविधि का पता लगाने ।
एगरोबैक्टीरियम sp. सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया तरीकों में से एक है ट्रांसजेनिक पौधों को प्राप्त करने के रूप में यह हस्तांतरण और संयंत्र जीनोम में अपने ही टी डीएनए एकीकृत करने की क्षमता है । यहां, हम आनुवंशिक रूप से संशोधित करने के लिए दो परिवर्तन प्रणाली वर्तमान आलू (Solanum ट्यूमोसम) पौधों । एक. tumefaciens परिवर्तन में, पत्तियों संक्रमित हैं, परिवर्तित कोशिकाओं का चयन कर रहे हैं और एक नया पूरा बदल संयंत्र 18 हफ्तों में phytohormones का उपयोग कर पुनर्जीवित किया है. एक. rhizogenes रूपांतरण में, उपजी एक सुई के साथ बैक्टीरिया इंजेक्शन से संक्रमित हैं, नए उभरे हुए बदल बालों वाली जड़ों एक लाल फ्लोरोसेंट मार्कर का उपयोग कर पता चला रहे हैं और गैर-रूपांतरित जड़ों को हटा रहे हैं । 5-6 सप्ताह में, जिसके परिणामस्वरूप संयंत्र पूरी तरह से विकसित बदल बालों की जड़ों के साथ एक जंगली प्रकार शूट का एक समग्र है । बायोमास को बढ़ाने के लिए, रूपान्तरित बालों की जड़ों excised और आत्म प्रचारित किया जा सकता है । हम एक सुबेरिन bioसंश्लेषित जीन प्रमोटर द्वारा संचालित गस रिपोर्टर जीन व्यक्त जड़ों को प्राप्त करने के लिए दोनों एगरोबैक्टीरियम-मध्यस्थता परिवर्तन विधियों को लागू किया । गस धुंधला करने की प्रक्रिया प्रदान की जाती है और प्रमोटर प्रेरण के सेल स्थानीयकरण की अनुमति देता है । दोनों विधियों में, रूपान्तरित आलू जड़ों suberized एंडोडर्मिस और exodermis, और अतिरिक्त में गस धुंधला दिखाया, और साथ ही, एक में rhizogenes बदल जड़ों गस गतिविधि भी पार्श्व जड़ों के उद्भव में पाया गया था । इन परिणामों का सुझाव है कि एक. rhizogenes एक तेजी से वैकल्पिक उपकरण जीन है कि जड़ों में व्यक्त कर रहे है अध्ययन किया जा सकता है ।
आर्थिक हित के अलावा, ट्रांसजेनिक पौधों की पीढ़ी अनुसंधान में अपनी प्रासंगिकता के लिए जीन के अंतिम कार्य को प्रदर्शित करने और बेहतर संयंत्र शरीर विज्ञान और विकास को समझते हैं । संयंत्र डीएनए प्रविष्टि के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि एगरोबैक्टीरियम-mediated परिवर्तन है । एगरोबैक्टीरियम ट्यूमेफेशियन्स अपने ट्यूमर-inducing (Ti) प्लाज्मिड की कार्रवाई से कई पौधों की प्रजातियों के संक्रमित ऊतक में मुकुट वाइरल उत्पन्न करने में सक्षम है । प्लाज्मिड में जीन के समुच्चय के साथ टी-डीएनए क्षेत्र होता है जो पादप जीनोम में एकीकृत होगा तथा ऊतक विविभेद1,2को प्रेरित करेगा । ट्रांसजीन द्वारा टी-डीएनए के भीतर इन जीनों के आदान-प्रदान से विशिष्ट पादप संशोधनों के उत्पादन की अनुमति दी गई है जो लक्षणप्ररूपी प्रभाव3से परहेज करते हैं । टी-डीएनए में ट्रांसजीन क्लोनिंग की सुविधा के लिए, टी-डीएनए क्षेत्र को बाइनरी प्लाज्मिड नामक एक स्वतंत्र प्लाज्मिड में उत्तेजित किया गया है, जबकि Ti प्लाज्मिड (वाइरलेंस जीन जो टी-डीएनए अंतरण और संमिलन तंत्रों की अनुमति देते हैं) के शेष जीन एक सहायक प्लाज्मिड में रखा गया । संयंत्र जैव प्रौद्योगिकी अनुसंधान के लिए, एक tumefaciens द्वारा परिवर्तन कई फायदे हैं: यह महंगा उपकरणों की जरूरत नहीं है, दोनों स्थिर और क्षणिक संयंत्र परिवर्तन उत्पन्न करने में सक्षम है, और जीन प्रतियों की कम संख्या में एकीकृत कर रहे हैं गुणसूत्र4. हालांकि, ज्यादातर पौधों के लिए, लेकिन नहीं arabidopsis, स्थिर परिवर्तनकारी पीढ़ी के एक एकल या कुछ कोशिकाओं बहिर्जात phytoहार्मोन्स का उपयोग करने से संयंत्र उत्थान की आवश्यकता है, इस प्रक्रिया श्रमसाध्य और समय लेने बनाने । ए rhizogenes भी संयंत्र जीनोम को संशोधित करने में सक्षम है, बालों की जड़ों या संक्रमण की अभिव्यक्ति के कारण साइटों पर आकस्मिक जड़ों का उत्पादन (जड़ loci) जड़ में इनकोडिंग जीन-inducing (आरआई) प्लाज्मिड5। हालांकि एक. tumefaciensसे कम अध्ययन किया, एक rhizogenes भी ट्रांसजेनिक जड़ों को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल होता है । इस मामले में, एक rhizogenes आरआई प्लाज्मिड में मूल टी डीएनए और एक दूसरे टी डीएनए transgene ले जाने के साथ एक द्विआधारी प्लाज्मिड शामिल हैं । जब संक्रमण साइट उपजी या hypocotyls में है, एक समग्र संयंत्र प्राप्त किया जा सकता है, नए बालों ट्रांसजेनिक जंगली प्रकार की शूटिंग से उभर जड़ों के साथ । वैकल्पिक रूप से, बालों में बदल जड़ें स्वायत्त कार्बन स्रोत आदानों के साथ मीडिया में विट्रो में विकसित कर सकते हैं । के बजाय ए. rhizogenes का उपयोग एक. tumefaciens के लिए ट्रांसजेनिक ऊतक का उत्पादन प्रासंगिकता प्राप्त कर रहा है जब जड़ लक्ष्य अंग है, क्योंकि संयंत्र पुनर्जनन की आवश्यकता नहीं है और इसलिए यह तेजी से और कम महंगा है । पिछले अध्ययनों में जड़ विशिष्ट जीन के लक्षणप्ररूपी लक्षण वर्णन6,7,8,9के लिए विनिकृत इस पद्धति का प्रदर्शन किया है ।
आलू (solanum ट्यूबरोसम) दुनिया में चौथी सबसे महत्वपूर्ण फसल संयुक्त राष्ट्र के खाद्य और कृषि संगठन (fao) के अनुसार है के बाद से कंद विटामिन का एक अच्छा स्रोत होने के लिए मानव उपभोग के लिए पोषण प्रासंगिकता है और खनिज । उस कारण से, आलू को कृषि जैव प्रौद्योगिकी की सुर्खियों में रखा गया है और आनुवंशिक और विकासात्मक अध्ययनों के लिए एक अच्छा जैविक मॉडल के रूप में भी माना जाता है10,11. आलू परिवर्तन काफी suberized और मोम जैव संश्लेषण में शामिल जीन के लक्षण वर्णन के माध्यम से suberized ऊतकों अंतर्निहित अणुओं तंत्र की समझ में योगदान12,13,14 ,15,16,17, सुबा्न मोनोमर ट्रांसपोर्ट18 और ट्रांसक्रिप्शन रेगुलेशन19. सुबेरिन फ्रोलोयल ट्रांस्फ़्रेज़ जीन, fht, इन विशेषता जैव सिंथेटिक जीन में से एक है; इसकी डाउनरेगुलेशन परित्वक् संरक्षण की एक मजबूत हानि को जंम देता है, जो आलू कंदों में सुबेरिन और waxes के ferulate एस्टर में एक मजबूत कमी के साथ सहसंबद्ध है14। सहवर्ती रूप से, अराबीडापोसिस की जड़ों और बीजों में, इसके ख्यात ऑर्थोलोग (एएसएफटी/RWP1) की पीटकर भी20,21में अल्किल फर्लेट्स के उत्पादन में अपनी भूमिका का प्रदर्शन किया । आलू में, fht transअपंग रिपोर्टर लाइन और fht एंटीबॉडी क्रमशः दिखाया है कि प्रमोटर गतिविधि और प्रोटीन exodermis में स्थित हैं, endodermis, phellogen-डेरिवेटिव और घायल ऊतकों में15।
इस काम में, हम विस्तार से एक प्रोटोकॉल का उपयोग कर एक. rhizogenes कि एक जंगली प्रकार गोली मार में बनाए रखा है ट्रांसजेनिक बालों की जड़ों का उत्पादन, संयुक्त आलू के पौधों का उत्पादन, या के लिए स्वायत्त रूप से विकसित करने के लिए excised विट्रो में। हम भी एक. tumefaciens का उपयोग कर प्रोटोकॉल प्रदान करने के लिए पूरा ट्रांसजेनिक आलू के पौधे प्राप्त करते हैं । एक मामला अध्ययन के रूप में, ए. rhizogenes और एक ही द्विआधारी सदिश के साथ तब्दील tumefaciens का उपयोग fht प्रमोटर ड्राइविंग गस रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति के साथ जड़ें प्राप्त करने के लिए किया जाता है । परिणाम रिपोर्ट और तुलना कर रहे हैं ।
आलू में, स्थिर पूर्ण ट्रांसजेनिक पौधों को प्राप्त करने के लिए सबसे आम प्रणाली एगरोबैक्टीरियम tumefaciens उपभेदों द्वारा परिवर्तन का उपयोग करता है कि बहिर्जात phytoहार्मोन्स का उपयोग कर ऑर्गेनोजेनेसिस की आ?…
The authors have nothing to disclose.
यह काम Ministerio डी Innovación वाई Ciencia द्वारा समर्थित (AGL2009-13745, FPI अनुदान पंजाब के लिए), Ministerio डी Economía वाई Competitividad और FEDER धन (AGL2012-36725, AGL2015-67495-C2-1-R), और Girona विश्वविद्यालय (एस एफ के लिए पीएचडी अनुदान, और अनुदान SING11/1). लेखक डॉ ईंगे Broer के लिए आभारी है (भूमि उपयोग के लिए संस्थान, रोस्टॉक विश्वविद्यालय, रोस्टॉक, जर्मनी) और डॉ Salomé Prat (सेंरो Nacional डे Biotecnología, मैड्रिड, स्पेन) एक. rhizogenes और एक. tumefaciens तनाव प्रदान करने के लिए, क्रमशः, और डॉ. Marçal Soler और डॉ अन्ना Plasencia मदद और सहायता के लिए एक. rhizogenes परिवर्तन प्रयोगों (टूलूज़ III पॉल Sabatier विश्वविद्यालय-Cnrs, संयंत्र अनुसंधान प्रयोगशाला (LRSV), Castanet Tolosan, शुरू करने में प्राप्त समर्थन के लिए फ्रांस) । लेखक सारा Gómez (Departament डे Biologia, UdG, Girona) धंयवाद प्रयोगशाला काम ले जाने और पौधों की देखभाल में उसे मूल्यवान सहायता के लिए, और Ferran Fontdecaba और कार्ला Sánchez जो प्रयोगों में से कुछ के साथ मदद की है जबकि वे कर रहे थे उनकी अंतिम डिग्री परियोजनाओं ।
Acetone |
Panreac |
1.310.071.21 |
|
Acetosyringone |
Acros |
115540050 |
|
Aquarium pump |
Prodac |
MP350 |
|
Autoclave |
Ragpa Strelimatic |
||
Bacteriological agar |
Lab Conda |
1800 |
|
BAP |
Duchefa |
B0904 |
|
Beef extract |
Lab Conda |
1700 |
|
Plant growing cabinet |
Nuaire |
||
Carbenicillin |
Duchefa |
C0109 |
|
Cefotaxime sodium |
Duchefa |
C0111 |
|
DMSO |
Merck |
1029310161 |
|
Ecotron infors |
HT |
29378 |
|
Ethanol |
Merck |
1,009,831,011 |
|
Falcon tube |
Control tecnica |
CFT011500 |
|
Ferricyanate |
Sigma |
101001081 |
|
Ferrocyanate |
Sigma |
100979088 |
|
Flask (8.06 cm diameter and 11.3 cm height) and plastic lid for in vitro culture |
Apiglass |
ref16 |
|
GA3 |
Sigma |
G7645 |
|
Gamborg B5 media |
Duchefa |
G0210 |
|
Gelrite |
Duchefa |
G1101 |
|
Glucosa |
Sigma |
G5767 |
|
Kanamycin |
Sigma |
K1377 |
|
Leukopor tape |
BSN Leukopor |
BDF47467 |
|
Lupe |
Wild-Heerbrugg |
M420 |
|
Magnetic shaker |
Agimatic |
7000243 |
|
MES hydrate |
Sigma |
M2933-25G |
|
MgSO4 |
Panreac |
131404 |
|
Microscope |
Olympus |
||
Minufugue centrifugue 5415R |
Eppendorf |
||
Murashige and Skoog media |
Duchefa |
M0254.0050 |
|
Na2HPO4 |
Panreac |
131679 |
|
NAA |
Duchefa |
N0903 |
|
NaCl |
Panreac |
131659 |
|
NaH2PO4 |
Sigma |
58282 |
|
NightSea Stereo |
SFA Moonting Adapter |
||
Parafilm |
Anorsa |
PRFL-001-001 |
|
Peptone |
Lab Conda |
1616 |
|
Petri dishes (90 x 14) |
Anorsa |
200200 |
|
pHmetre |
Crison |
||
Phytotron |
Inkoa |
RFTI-R5485 |
|
Plant Agar |
Duchefa |
P1001 |
|
Refrigeratot |
Liebherr Medline |
||
Rifampicin |
Duchefa |
R0146 |
|
Spectinomycin |
Sigma |
59007 |
|
Spectrophotometer |
Shimadzu |
||
Square plates (120 x 120) |
Deltalab |
200204 |
|
Streptomycin |
Sigma |
S6501 |
|
Sucrose |
Panreac |
131621 |
|
Surgical blades |
Swann-Morton |
201 |
|
Surgical needle |
NIPRO |
015/0204 |
|
Triptone |
Lab Conda |
1612 |
|
Triton |
Serva |
37240 |
|
Unimax 1010 shaker |
Heidolph |
||
Vacuum |
Dinko |
||
x-GlcA (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronic acid, sodium salt anhydrous) |
Biosynth |
B-7398 |
|
Yeast extract |
Lab Conda |
1702.00 |
|
Zeatin riboside |
Sigma |
1001042850 |