Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att isolera dendritiska celler från murina mjälte av magnetiska cell sortering och efterföljande överföring i naiva möss. Modell av hög salthalt aktiverade dendritiska celler valdes för att förklara de stegvisa procedurerna för överföring och flödescytometri.
Abstract
Överflödigt salt intaget bidrar till inflammation och spelar en viktig roll i utvecklingen av hypertoni. Vi hittade tidigare att antigen-presenterande dendritiska celler (DCs) kan känna förhöjda extracellulära natrium leder till aktivering av den NADPH-oxidasen och bildandet av isolevuglandin (IsoLG)-protein addukter. Dessa IsoLG-protein addukter reagera med self-proteiner och främja en autoimmun-liknande tillstånd och hypertoni. Vi har utvecklat och optimerat state-of-the-art metoder för att studera DC funktion vid hypertoni. Här, vi ger ett detaljerat protokoll för isolering, i vitro behandling med förhöjda natrium, och överföring av murina mjälten CD11c+ celler i mottagarens möss att studera deras roll vid hypertoni.
Introduction
Överflödig kost salt är en stor riskfaktor för hypertoni. 1 , 2 the American Heart Association rekommenderar högst 2 300 milligram (mg) natrium (Na+) intag per dag, dock; mindre än 10% av den amerikanska befolkningen har påpekat denna rekommendation. 3 , 4 blygsamma minskningar i Na+ intag sänker blodtrycket och minska de årliga nya fall av hjärt-kärlsjukdomar och stroke i USA med 20%. 5 stora problem med överflödig saltkonsumtion är att 50% av hypertonipopulationen utställningar salt-känslighet, definierades som en ökning av blodtrycket efter NaNa+ lastning eller en liknande blodtrycksfall med 10 mmHg + begränsning och Diures. 6 salt-känslighet också förekommer i 25% av normotensiva individer och är en oberoende prediktor av död och kardiovaskulära händelser. 7 , 8 salt-sensing mekanismer vid hypertoni som involverar njuren har också studerats; Nyare studier antyder dock att immunceller kan känna Na+. 9 , 10
Nyligen tyder på att förändringar i extra nedsatt Na+ hantering kan orsaka ansamling av Na+ i interstitium och främja inflammation. 11 , 12 vårt laboratorium och andra har visat att celler både medfödd och adaptiv immunsystemet bidrar till Förvärrande av hypertoni. 9 , 13 , 14 , 15 olika hypertensiva stimuli, inklusive angiotensin II, noradrenalin och salt orsak makrofager, monocyter och T-lymfocyter att infiltrera njurarna och blodkärlen och främja Na+ lagring, vasokonstriktion, blodtryck höjd och organskada. 9 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 i tidigare studier fann vi att DCs ackumulerar isolevuglandin (IsoLG)-protein addukter som svar på olika hypertensiva stimuli inklusive angiotensin II och DOCA-salt hypertoni. 14 IsoLGs är mycket reaktiva produkter av lipidperoxidation som snabbt och kovalent addukt till lysines på proteiner och deras anhopning är associerad med DC aktivering. 14 vi har nyligen fastställt att förhöjda Na+ är en potent stimulans för IsoLG-protein addukt bildandet i murin DCs.9 Na+ trätt i DCs medieras genom amilorid känsliga transportörer. Na+ växlas sedan kalcium (Ca2 +) via Na+/ca2 + värmeväxlaren. Ca2 + aktiverar proteinkinas C (PKC) som aktiverar den NADPH-oxidas som leder till ökad superoxid (O2· -) och IsoLG-protein addukt bildandet. 9 överföring av salt-exponerade DCs primtal hypertoni som svar på en sub Blodtryckshöjande dos av angiotensin II. 9
Identifiering av CD11c+ DCs från vävnader har tidigare begränsats till immunhistokemi och RT-PCR och isolering av DCs har begränsats till cellen sortera av flödescytometri. Även om flödet flödescytometri cell sortering är en kraftfull metod för isolering av immunceller, det är dyrt, tidskrävande, och leder till en låg avkastning av viabla celler. Därför vi har optimerat ett steg protokoll för vävnad matsmältningen, in vitro-stimulering och överföring av CD11c+ DCs att studera hypertoni.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vanderbilt Universitys institutionella djur vård och användning kommittén har godkänt de förfaranden som beskrivs häri. Möss är inrymt och vårdas enligt guiden för skötsel och användning av försöksdjur (nationella akademier tryck. Reviderad 2010).
1. isolering av mjälte från möss
- Förbereda 1640 RPMI: 10% FBS, 0,10 mM HEPES, 1 mM natrium Pyruvat, 50 µM β-merkaptoetanol och 1% penicillin/streptomycin.
- Avliva 10 – 12 veckors-gamla C57bl/6 hanmöss av CO2 inandning. Spraya i bröstet och på sidorna av musen med 70% etanol. På vänster sida, öppna försiktigt huden och i bukhålan att exponera mjälte.
- Med liten pincett, försiktigt flytta tarmarna och levern till vänster sida av musen, och använda fin sax försiktigt punktskatt mjälte.
Obs: Detta steg måste göras mycket noggrant eftersom skador på mag-tarmkanalen kan framkalla kontaminering. - Placera varje exciderad mjälte i märkta 15 mL koniska rör innehållande 3 mL RPMI 1640 medium.
2. generering av enda cellsuspensioner från mjälte
Obs: Mjälten kan avskiljas till en enda cellsuspension genom att kombinera mekanisk dissociation plus enzymatisk nedbrytning.
- Bered den mjälte matsmältningen genom att lägga till kollagenas D (1 mg/mL; 0,29 U/mg frystorkade) och DNAS I (0,1 mg/mL) till beredd RPMI 1640 medium (se steg 1.1)
- Använda pincett för att överföra mjälte till en C rör (dissociation tub) innehållande 3 mL mjälte matsmältningen lösning.
-
Utföra mekanisk dissociation med en halvautomatisk Homogenisatorer enligt tillverkarens anvisningar.
- Placera röret C på den halvautomatiska Homogenisatorer, att säkerställa att C röret placeras tätt på den roterande arm. När C röret placeras, tryck på start-knappen på den halvautomatiska homogenisatorn att köra mjälte 04.01 protokollet för 60 s.
Obs: Mekaniska dissociation kan också utföras genom att placera en 40 μm filter ovanpå en 50 mL konisk tub och försiktigt slipning mjälte genom filtret. Efter slipning mjälte, genom skölj filtret 40 µm med 10 mL RPMI media.
- Placera röret C på den halvautomatiska Homogenisatorer, att säkerställa att C röret placeras tätt på den roterande arm. När C röret placeras, tryck på start-knappen på den halvautomatiska homogenisatorn att köra mjälte 04.01 protokollet för 60 s.
- Efter mekanisk dissociation, lossa röret från homogenisatorn och utföra enzymatisk nedbrytning. Inkubera proverna för 15 min vid 37 ° C under kontinuerlig rotation (20 rpm).
- Överför lösningen med pipett till en 50 mL konisk tub efter filtrering genom en 40 µm sil. Tvätta 40 µm Silen med 10 mL Dulbecco's PBS (dPBS). Centrifugera cellerna vid 300 x g under 10 minuter vid 4 ° C.
- Efter centrifugering, aspirera supernatanten helt och tvätta pelleten genom omblandning i 10 mL dPBS. Centrifugera vid 300 x g under 10 minuter vid 4 ° C.
3. isolering av CD11c+ DCs från mjälten enda cellsuspension
- Återsuspendera cellpelleten i 5 mL av dPBS och räkna antalet celler med hjälp av en hemocytometer och trypan blå utslagning.
- Pellet cellerna genom centrifugering 300 x gunder 10 minuter vid 4 ° C.
- Helt aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten i 400 µL av magnetiskt aktiverade cell-sortering (Mac)-buffert.
- Tillsätt 100 µL av CD11c Mikrokulor (se Tabell för material) per 1 x 108 celler.
- Vortex cellsuspensionen och inkubera i 10 min i kylskåpet vid 4 ° C.
- Tillsätt 10 mL av MACs buffert att tvätta cellerna. Centrifugera vid 300 x g under 10 minuter vid 4 ° C.
- Helt aspirera supernatanten och återsuspendera i 500 µL av Mac-buffert.
4. magnetisk separering av CD11c+ DCs
Obs: Magnetisk separering sker manuellt med en magnetisk separator (se Tabell för material) utrustade med LS kolumner. Magnetisk separering kan också göras automatiskt med en automatiserad magnetiska avskiljare. (se Tabell för material).
- Placera kolumnen LS i det magnetiska fältet i MACs avgränsare och ett 15 mL koniska rör under varje kolumn att samla genomflöde.
- Skölj kolumnen LS med 3 mL buffert.
- Placera cellsuspension på varje LS-kolumnen och samla in den genomströmmande innehållande omärkt celler.
- Tvätta LS kolonnen med 3 mL MACs buffert samla de omärkta celler som passerar. Tvätta kolumnen LS 2 gånger.
- Ta bort kolumnen LS från den magnetiska avskiljaren. Tillsätt 5 mL av MACs buffert till varje kolumn och omedelbart spola ut de magnetiskt märkta cellerna av fast störta kolumnen LS i en ren 15 mL koniska rör.
Obs: Det är viktigt att utföra en dubbel isolering av CD11c celler att erhålla en hög renhet cellsuspension. Därför upprepa steg 3.1 genom 4.5. och hänvisa till figur 4 för renhetsstandarder. Detta steg förbättrar renheten av CD11c+ celler till 90 – 95%. -
Bestämma CD11c+ DC nummer på en hemocytometer med trypan blå utslagning. Späd cell provet vid en spädning 1:1 med 0,4% trypan blå lösning.
Obs: icke-viabla celler kommer att färgas blå, medan viabla celler förblir ofärgade.- Detta gör noggrant fylla en hemocytometer med 10 µL av den cell provspädningen och inkubera i 1 minut.
- Räkna celler i 4 rutor av 1 x 1 mm2 i kammaren som har lästs för att bestämma antalet livskraftiga celler.
5. i Vitro hög Salt behandling av CD11c+ DCs
- Förbereda DC odlingsmedium genom att lägga till 10% FBS, 0,1 mM HEPES, 1 mM natrium Pyruvat, 50 µM β-merkaptoetanol och 1% penicillin/streptomycin till 500 mL 1640 RPMI.
- Förbereda 10 x DC hög salt cell kultur media (400 mM) genom vägning ut 1,17 g NaCl och placera det i en steril 50 mL falconrör. Tillsätt 50 mL steril DC cell kultur media (bereddes i steg 5.1) till 50 mL falconrör och vortex tills NaCl är i lösning.
- Filtrera omedelbart den hög salt DC kultur media med dammsugarfilter genom ett 0,2 μm filter i en cell kultur huva.
- Centrifugera varje cellsuspension från mjälte vid 300 x g i 10 min vid 4ºC. Återsuspendera varje cellpelleten i DC kultur media vid en koncentration på 1 x 106 celler/mL.
- Tillsätt 900 μL (ca 1 x 106 celler) DC suspensionen i en 24-väl platt botten Falcon plattan. Tillsätt 100 µL av hög salt DC kultur media till varje brunn för en sista natriumkoncentration av 190 mM. Etikett på plattan och plats i en 37 ° C humified CO2 inkubator för 48 h.
6. överföring av hög salthalt behandlas CD11c+ DCs
- In vitro-Stimulation för 48 h humified ta bort plattan från 37 ° C CO2 inkubator.
- Pipettera cell kultur media upp och ner till omsuspendera CD11c+ DCs. Pipettera alla CD11c+ DC suspension till en motsvarande märkt 1,6 mL tub. Upprepa detta steg för varje individ som väl förkromad.
- Centrifugera varje CD11c+ DC fjädring på 300 x g under 10 minuter vid 4 ° C. Aspirera supernatanten. Återsuspendera pelleten DC med 100 µL sterilt dPBS.
- Rita DC suspension i en 1 mL spruta försedd med en 27 G ½ tum nål.
- Placera de naiva manliga 10 veckor gamla C57bl/6 möss under 2% isofluran att uppnå en stabil kirurgiska planet. Kontrollera nivån av anestesi med bristen på pedal reflexen. När ett stabilt kirurgiska plan uppnås, långsamt och försiktigt in nålen i retro-orbital utrymmet i en vinkel på ca 30°.
Obs: Avfasningen på 27 G nålen ska peka nedåt, från ögat, att förhindra okulär skador. - Långsamt och smidigt injicera CD11c+ DC suspension (ca 1 x 106 celler). När injektionen är klar, ta försiktigt bort nålen för retro-orbital utrymme att vara medveten att inte skada ögat.
Obs: Efter injektionen bör det finnas lite eller ingen blödning. Överföring av CD11c+ DCs kan också utföras med hjälp av en I.V. injektion (e.g. svans ven). Kontroll möss får CD11c+ DCs som odlades i normala salt media. - Ta bort mössen från näsan konen och övervaka dem i ca 30 min under återhämtning från anestesi.
7. förberedelse av 14 dagars låg dos Angiotensin II (140 ng/kg/min)
- Förbereda angiotensin II bufferten genom att lägga till 500 μL 5 M NaCl och 300 μL av ättiksyra. Quantum Satis (QS) upp till 30 mL avjoniserat H20.
- Lös upp angiotensin II till 5 mg/mL av utgångslösningen med angiotensin II-buffert. Späd angiotensin II stamlösning med extra buffert att uppnå en slutlig koncentration så att det osmotiska minipump kommer att leverera angiotensin II i ett 140 ng/kg/min enligt kroppsvikt varje mus.
Obs: Väsentliga Angiotensin II (mg) = (mus vikt (g) x 0,2 mg / dag x 14 dagar) / 1000
Beredd Angiotensin II (mg) = (väsentliga angiotensin II x 260 µL) / pump rate (0,25 μL/hr)
Angiotensin II lager volym (μl) = beredda angiotensin II / aktiemarknaden koncentration (5 mg/mL) x 1,000
Späd volym (μl) = 270 - angiotensin II lager volym - Lägga till angiotensin II lager volym till den utspädda (angiotensin II buffert) baserat på de volymer som beräknades i steg 7,2.
- Under sterila cell kultur huva, öppna osmotisk minipump.
- Lägg till utspädda angiotensin II lösning och utvisa någon luft från sprutan och nålen. Stick in medföljande nålen i botten av den osmotiska minipump och injicera långsamt angiotensin II lösning medan långsamt och försiktigt upprullningskraften nålen från blåsan.
- Infoga osmotisk minipump huvudet i osmotisk blåsan fullständigt, uppmärksamma inte fick någon luft in i urinblåsan.
8. implantation av 14 dagars låg dos Angiotensin II osmotisk men framförallt minipumpar
- Tio dagar efter överföring av CD11c+ DCs, plats möss i en isofluran kammare att initiera anestesi och sedan flytta möss till näsan konen att kontinuerligt få 2% isofluran för att uppnå och bibehålla en lämplig kirurgisk planet.
- Ta bort pälsen längs ryggsidan av halsen med clippers att förbereda operationsområdet. Ren rakade området med 70% etanol följt av 7,5% betadine före starten av operation.
- Skapa ett litet snitt (ca 1,5 cm) i huden. In i snitt för att skapa en subkutan ficka för placering av den osmotiska minipump Peanger.
- Infoga minipump i subkutan fickan. Nära huden såret med 2-3 kirurgiska häftklamrar och tillämpa en annan tillämpning av 7,5% betadine på såret och staples att förhindra infektion.
- Övervaka möss för 30 – 60 min under återhämtning från anestesi återvända dem till deras burar.
Obs: Möss behöver vara övervakas upp till 3 – 4 dagar efter implantation av den osmotiska minipump.
9. isolering av mjälte av mottagarens möss för flöde flödescytometrisk analys
- Efter 14 dagar av låg dos angiotensin II-infusion, isolera behandlade mjälte från möss som fick in vitro-hög salthalt DCs av överföring. Följ de exakta stegen ovan (steg 1 och 2).
10. ytan färgning
-
Överföra splenocytes som är resuspended i 1 x PBS till en polystyren FACS rör och centrifugera vid 350 x g under 8 minuter vid 4 ° C. Sug ut supernatant efter centrifugering. Tvätta två gånger med 1 mL av MACs buffert och centrifugering (350 x g, 8 min, 4 ° C).
- Dela in splenocytes lika i olika polystyren FACS rör baserat på antalet flöde flödescytometrisk paneler önskas.
- För att utföra Live/Dead Cell livskraft färgningen, tvätta cellerna med 1 x PBS och centrifugera (350 x g, 8 min, 4 ° C). Återsuspendera i 1 mL 1 x PBS och tillsätt 1 µL cell-lönsamhet fläcken (se material tabell). Inkubera i 15 minuter vid 4 ° C (kylskåp eller på is) omfattas i folie för att skydda mot ljus.
- Under inkubation cell livskraft fläcken, förbereda cocktailen av antikroppar för cellytan färgning i en lämplig volym av Mac-buffert.
- Tvätta cellerna med 1 mL av MACS buffert, centrifug (350 x g, 8 min, 4 ° C), och resuspendera varje cellpelleten med 100 µL av antikroppen cocktail. Inkubera skyddas från ljus under 30 minuter vid 4 ° C.
Obs: Varje flöde flödescytometri antikropp är unik, och det är mycket användbart och rekommenderas att bestämma den optimala mängden antikroppar som behövs genom att utföra en dos titrerkurvan för varje specifik antikropp. - Tvätta cellerna två gånger med 1 mL av MACS buffert och återsuspendera splenocytes i en lämplig mängd MACS buffert för flöde flödescytometrisk analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 representerar en schematisk av beskrivs stegen ovan. Isolerade murina mjälte sorteras för CD11c+ DCs av magnetiska cell sortering och klädd i normala salt media (NS; 150 mmol NaCl) eller hög salt media (HS; 190 mmol NaCl) för 48 h. CD11c+ DCs överförs därefter adoptively av retro-orbital injektion till naiva mottagarens möss. Tio dagar senare, implanteras möss med osmotisk men framförallt minipumpar precis vid infusionsvätska låg dos angiotensin II (140 ng/kg/min) i 14 dagar. Under 14-dagars infusionen av angiotensin II, skall blodtryck registreras med radio telemetri eller svans-manschett pletysmografi.
En typisk blodtryck analys är representerade i figur 2 (modifierad från Barbaro et al.9) efter överföring av DCs och osmotisk men framförallt minipumpar för låg dos angiotensin II infusion implanteras. Att notera, detta låg dos av angiotensin II (140 ng/kg/min) är en sub Blodtryckshöjande dos som inte ökar blodtrycket i en normal mus. Möss som får normal salt behandlade CD11c+ DCs (svarta cirklar) upprätthålla ett normalt blodtryck under angiotensin II infusionen, medan möss som får hög salt behandlade CD11c+ DCs (röda cirklar) uppvisar en ökning av systoliskt blodtryck. Figur 2 illustrerar att hög salt behandlas CD11c+ DCs prime hypertoni som svar på en sub Blodtryckshöjande dos av angiotensin II.
Att bestämma renheten av den isolerade CD11c+ celler, vi utfört flödescytometri flödesanalys med en usenets strategi som illustreras i figur 3A. Vi hittade som jämfört med den totala splenocytes, vi uppnått ökad anrikning av CD11c+ celler (figur 3B). Vi utnyttjas olika CD11c microbead koncentrationer för att felsöka tillverkarens protokollet i figur 4. Efter magnetisk separering av splenocytes använder 100 μL (figur 4A), 200 μL (figur 4B) eller 300 μL (figur 4C) CD11c Mikrokulor ger ca 65%, 55% och 50% av CD11c+ positiva celler respektive. Vi ingår sedan en FcR blockerare (5 μL/mjälte) + 100 μL av CD11c microbead, magnetiskt separerade, och fann att blockad av FcR avkastningen cirka 65% CD11c positiva celler (figur 4D). I ytterligare experiment, vi inkuberas splenocytes i 100 μL CD11c Mikrokulor och magnetiska separeras genom en LS-kolumn. Vi sedan inkuberas separerade cellerna med en ytterligare 100 μL av CD11c Mikrokulor och igen avskilt genom en LS-kolumn. Dubbel isolering av splenocytes gav 92% CD11c+ celler (figur 4E).
Figur 1 : Illustration av överföring av in vitro-behandlade CD11c + DCs. CD11c+ DCs isoleras från mjälte möss och klädd i antingen normal salt eller hög salt media för 24 h. CD11c+ DCs adoptively överförs sedan retro-orbitally i naiva mottagarens möss. En osmotisk minipump infusion låg dos angiotensin II implanteras och blodtryck övervakas i 14 dagar. Denna siffra är anpassad från Barbaro et al.) 9. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2 : Effekten av hög salthalt behandlas CD11c + DCs systoliskt blodtryck. Dendritiska celler var isolerade och odlade i normala salt (NS) eller hög salthalt (HS) för 48 h. DCs överfördes adoptively till vildtyp naiva möss. Ang II men framförallt minipumpar (140 ng/min) var implanteras och blodtryck övervakas av radio telemetri. Systoliskt blodtryck (SBP) mätt med radio telemetri (medelvärde ± SEM). Denna siffra är anpassade från Barbaro et al.9vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3 : Flow flödescytometrisk analys av magnetiskt separerade splenocytes. (A) Gating strategi definierar analys av CD11c + DC befolkningen. Celler separeras från skräp och levande celler är utvalda baserat på uteslutandet av Live/Dead cell fläcken. Singlet celler väljs ut och sedan analyseras för CD45 positivitet. CD45 cellerna analyseras sedan för CD11c. (B) efter magnetisk separering, finns det betydande anrikning av CD11c +-celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Flow flödescytometrisk analys av magnetiskt separerade CD11c+ splenocytes efter olika isolering protokoll. Celler skildes från skräp och levande celler. Levande celler analyserades för jag-Ab och CD11c positivitet. (A) % av CD11c+ celler efter magnetisk separation som isolerades med 100 μL, (B), 200 µL, (C) 300 μL av CD11c Mikrokulor. (D) % av CD11c+ celler efter magnetisk separation som isolerades med blockad av FcR (anti-FcR; 5 μL) + 100 μL CD11c Mikrokulor. (E) % av CD11c+ celler efter magnetisk separation som var isolerade med dubbla magnetiska cell sortering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I det nuvarande protokollet, vi har optimerat förfaranden för att isolera CD11c+ DCs från mjälte möss och adoptively överföra dem till naiva djur att studera DCs roll i salt-inducerad hypertoni. Detta protokoll kan anpassas att isolera och adoptively överföra andra immunceller undergrupper bland annat makrofager och monocyter adaptiv immunceller inklusive T- och B-lymfocyter. Vi har optimerat mjälten rötningsprocessen för att uppnå tillräcklig cellöverlevnad och stabilitet av DC ytan uttryck markörer. Dessutom har vi optimerat protokollet för in vitro-stimulering av murina DCs med förhöjda natrium för optimal DC överlevnad.
Ett avgörande steg i detta protokoll är magnetiska cell sortering. Magnetiska cell sortering är ett kraftfullt och praktiskt verktyg att isolera specifika murina celltyper för att studera immunceller funktion vid sjukdom. Men, det är baserat på grundläggande cell surface uttryck markörer inklusive CD11c som uttrycks ofta på mer än en typ av immunceller och ofta ger en mindre än önskvärt viss cell berikning. Således för applikationer som kräver en mycket specifik population av celler, kan det vara nödvändigt att fläcken med flera antikroppar och sortera av flödescytometri att eliminera kontaminerande celler. Det är också viktigt att bekräfta anrikning och renhet av isolerade celler med hjälp av flödescytometri som visas i figur 3 och figur 4. I det nuvarande protokollet, har vi utfört flera felsökningssteg inklusive användning av olika koncentrationer av CD11c pärlor, blockad av FcR, och tillämpa en andra magnetiska cell sortering protokoll till de isolera cellerna. Vi fann att dubbel magnetiska cellen sortera uppnådde den högsta graden av CD11c+ cell renhet.
En annan avgörande steg för att förstå funktionen av isolerade DCs är in vitro-stimulering med hög salthalt och kultur. Medan vi hitta att detta aktiverar DCs orsakar dem att predisponera möss för hypertoni,9 in vitro-stimulering och kultur kan orsaka celldöd och införa andra tillstånd som potentiellt kan störa forskningsresultat. Dessutom för att få tillräckligt livskraftigt DCs, kan man behöva pool mjälte flera möss att få en lyckad överföring. För att eliminera potentiella artefakt effekterna av ex vivo odling av celler, kan det vara nödvändigt att adoptively överföra DCs isolerade från hög salt-matade möss. I tidigare studier har vi isolerade DCs som har stimulerats in vivo i möss infunderas med angiotensin II och fann att dessa prime hypertoni i mottagarens möss. 14 i framtida studier, vi kan stimulera DCs Invivo använder salt-inducerad hypertoni inklusive DOCA salt eller L-namn/hög salt och avgöra om de aktivera T-celler och prime hypertoni.
En annan begränsning i detta protokoll är relaterat till den tekniska aspekten av framgångsrika intravenös överföring av immunceller. Retro-orbital ven injektion av DCs kan vara svårt och bör göras av en högt utbildad kirurg. Alternativt adoptively överföring av DCs kan uppnås genom svansen ven injektion men detta tenderar att vara lättare i vitt jämfört med svart möss.
Trots dessa tekniska begränsningar är magnetiska cell sorterings- och adoptiv överföringen av DCs en extremt kraftfull teknik som möjliggör identifiering och karakterisering av den funktionella rollen för DCs i hjärt-och njursjukdom staterna. Det är viktigt att utvärdera engraftment och homing av celler i olika organ relaterade till hjärt-kärlsjukdom efter överföring. I tidigare studier har visasi vi adoptively DCs från möss transgena för Enhanced grönt fluorescerande protein naiva mottagarens möss. Vi sedan utförs flödescytometri av olika vävnader i mottagarens mössen tio dagar senare och fann att dessa celler huvudsakligen ansamlas i mjälten av mottagarens möss, och i mindre utsträckning i njure och aorta. Detta ökades om givaren musen behandlades med angiotensin II. Den relativa engraftment av normal kontra salt-behandlade DCs och specifik vävnad platser fortfarande måste undersökas.
Vi har Sammanfattningsvis beskrivs och optimerad en detaljerad och reproducerbara protokoll magnetiskt separat, adoptively överföra och bedöma DC populationer av flödescytometri. Detta protokoll kan tillämpas på andra immunceller populationer (med vissa ändringar) och andra modeller av hjärt-kärlsjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av American Heart Association beviljar POST290900 N.R.B., 17SDG33670829 L.X. och National Institutes of Health bevilja K01HL130497 Arvidsson
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC/Cy7 anti-mouse CD11c | Biolegend | 117324 | |
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| CD11c MicroBeads Ultrapure | Miltenyi Biotec | 130-108-338 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| DPBS without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CV | |
| FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| FITC anti-mouse CD45 | Biolegend | 103108 | |
| GentleMACS C tube | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| GentleMACS dissociator device | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Use protocol: Spleen 04.01 |
| LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit | Invitrogen | L34964 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| QuadroMACs Seperator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11835-030 |
References
- Kearney, P. M., et al. Global burden of hypertension: analysis of worldwide data. Lancet. 365, 217-223 (2005).
- Murray, C. J., Lopez, A. D.
- Lev-Ran, A., Porta, M. Salt and hypertension: a phylogenetic perspective. Diabetes/metabolism research and reviews. 21, 118-131 (2005).
- Frisoli, T. M., Schmieder, R. E., Grodzicki, T., Messerli, F. H. Salt and hypertension: is salt dietary reduction worth the effort. The American journal of medicine. 125, 433-439 (2012).
- He, F. J., Li, J., Macgregor, G. A. Effect of longer-term modest salt reduction on blood pressure. Cochrane Database Syst Rev. 4, 004937 (2013).
- Weinberger, M. H., Miller, J. Z., Luft, F. C., Grim, C. E., Fineberg, N. S. Definitions and characteristics of sodium sensitivity and blood pressure resistance. Hypertension. 8, 127-134 (1986).
- Morimoto, A., et al. Sodium sensitivity and cardiovascular events in patients with essential hypertension. Lancet. 350, 1734-1737 (1997).
- Weinberger, M. H., Fineberg, N. S., Fineberg, S. E., Weinberger, M. Salt sensitivity, pulse pressure, and death in normal and hypertensive humans. Hypertension. 37, 429-432 (2001).
- Barbaro, N. R., et al. Dendritic Cell Amiloride-Sensitive Channels Mediate Sodium-Induced Inflammation and Hypertension. Cell Rep. 21, 1009-1020 (2017).
- Kirabo, A. A new paradigm of sodium regulation in inflammation and hypertension. American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 313, 706-710 (2017).
- Machnik, A., et al. Macrophages regulate salt-dependent volume and blood pressure by a vascular endothelial growth factor-C-dependent buffering mechanism. Nat Med. 15, 545-552 (2009).
- Kopp, C., et al. 23Na magnetic resonance imaging-determined tissue sodium in healthy subjects and hypertensive patients. Hypertension. 61, 635-640 (2013).
- Dixon, K. B., Davies, S. S., Kirabo, A. Dendritic cells and isolevuglandins in immunity, inflammation, and hypertension. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 312, 368-374 (2017).
- Kirabo, A., et al. DC isoketal-modified proteins activate T cells and promote hypertension. J Clin Invest. 124, 4642-4656 (2014).
- McMaster, W. G., Kirabo, A., Madhur, M. S., Harrison, D. G. Inflammation, immunity, and hypertensive end-organ damage. Circ Res. 116, 1022-1033 (2015).
- Harrison, D. G., Vinh, A., Lob, H., Madhur, M. S. Role of the adaptive immune system in hypertension. Curr Opin Pharmacol. 10, 203-207 (2010).
- Madhur, M. S., et al. Interleukin 17 promotes angiotensin II-induced hypertension and vascular dysfunction. Hypertension. 55, 500-507 (2010).
- Harrison, D. G., et al.
- Crowley, S. D., et al. Stimulation of lymphocyte responses by angiotensin II promotes kidney injury in hypertension. American journal of physiology. Renal physiology. 295, 515-524 (2008).
- Zhang, J. D., et al. A novel role for type 1 angiotensin receptors on T lymphocytes to limit target organ damage in hypertension. Circ Res. 110, 1604-1617 (2012).
