توزيع المياه Xylem في النباتات الخشبية تصور مع مجهر إلكترون المسح بالتبريد
Summary
مراقبة توزيع المياه داخل إكسيليم يوفر معلومات هامة فيما يتعلق بديناميات تدفق المياه في النباتات الخشبية. في هذه الدراسة، ونحن نبين النهج العملي لمراقبة توزيع المياه xylem في الموقع باستخدام كريوستات وcryo-SEM، الذي يلغي التغيرات الفنية في حالة المياه أثناء إعداد العينة.
Abstract
يسمح مجهر إلكترون المسح الضوئي المثبت باستخدام وحدة التبريد (cryo-SEM) بمراقبة العينات عند درجات حرارة دون الصفر، وقد استخدم لاستكشاف توزيع المياه في أنسجة النباتات بالاقتران مع تقنيات تثبيت التجميد باستخدام النيتروجين السائل (LN) 2). بالنسبة للأنواع الخشبية ، ومع ذلك ، فإن الاستعدادات لمراقبة سطح القطع العرضية xylem تنطوي على بعض الصعوبات بسبب اتجاه الألياف الخشبية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يؤدي التوتر العالي في عمود المياه في قنوات إكسيليم في بعض الأحيان إلى تغييرات في توزيع المياه، وخاصة أثناء تثبيت العينة وجمعها. في هذه الدراسة، ونحن نبرهن على إجراء فعال لمراقبة توزيع المياه داخل xylem من النباتات الخشبية في الموقع باستخدام كريوستات وCRYO-SEM. في البداية، خلال جمع العينات، يجب أن يقيس قياس إمكانات المياه إكسيليم ما إذا كان التوتر العالي موجود في قنوات إكسيليم. عندما تكون إمكانات المياه زيليم منخفضة (< ما هو ; 0.5 باسكال) ، هناك حاجة إلى إجراء تخفيف التوتر لتسهيل الحفاظ على أفضل من حالة المياه في قنوات xylem أثناء تثبيت العينات. بعد ذلك، يتم إرفاق طوق محكم حول جذع شجرة ومليئة LN2 لتثبيت تجميد حالة المياه من xylem. وبعد الحصاد، ينبغي الحرص على ضمان حفظ العينة المجمدة مع استكمال إجراءات إعداد العينات للمراقبة. يتم استخدام كريوستات لفضح بوضوح سطح القطع العرضي زيليم. في عمليات الملاحظات cryo-SEM، يلزم تعديل الوقت لتجميد الحفر لإزالة غبار الصقيع وإبراز حافة جدران الخلية على سطح المشاهدة. تظهر نتائجنا إمكانية تطبيق تقنيات cryo-SEM لمراقبة توزيع المياه داخل إكسيليم على المستويات الخلوية ودون الخلوية. ومن شأنه أن يحسن الجمع بين تقنيات الرصد في الموقع غير المدمرة بين نظام التبريد والتبريد والمياه في المياه بشكل عميق من استكشاف ديناميات تدفق المياه في النباتات الخشبية.
Introduction
إن توافر الموارد المائية (أي التهطال ومحتوى مياه التربة) يحدد بدقة معدل الوفيات والتوزيع الجغرافي لأنواع النباتات، حيث أنها تحتاج إلى امتصاص المياه من التربة ونقلها إلى أوراق إنتاج التمثيل الضوئي. يجب على النباتات الحفاظ على شبكة النقل المائي الخاصة بها تحت إمدادات المياه المتقلبة. وعلى وجه الخصوص، تولد النباتات الخشبية توترات عالية في قنواتها على طول مجاري الناحيات، حيث أنها تحتاج في بعض الحالات إلى الاحتفاظ بتاجها على ارتفاع يزيد عن 100 متر فوق سطح الأرض. للحفاظ على أعمدة المياه تحت هذا الضغط السلبي العالي، قنوات xylem تتكون من سلسلة متصلة من الخلايا الأنبوبية مع جدران الخلايا الصلبة ومحصنة المسعورة1. إن ضعف الضعف في ضعف القناة إكسيليم لقنوات إكسيليم في كل نوع هو عامل محدد جيد لبقاء الأنواع تحت إمدادات المياه المتقلبة2. وبالإضافة إلى ذلك، فإن دراسة حالة المياه من قنوات xylem مهم لتقييم الحالة الصحية للأشجار الفردية التي تتعرض لضغوط لاأحيائية أو حيوية. قياس تدفق النسغ أو إمكانية المياه يمكن أن توفر تقديرات لحالة المياه مصنع خشبي بسبب وظيفة هيدروليكية متكاملة من قنوات xylem. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يؤدي تصور توزيع المياه في خلايا إكسيليم إلى توضيح حالة المكونات الفردية للنظام الهيدروليكي إكسيليم.
توجد عدة تقنيات لتصور حالة المياه من قنوات xylem3. الأساليب الكلاسيكية والمفيدة لمراقبة مسارات المياه في الأنسجة الخشبية تنطوي على تلطيخ عمود الماء عن طريق غمر نهايات قطع الفروع في صبغ أو عن طريق حقن صبغة في شجرة دائمة ينبع4. كما يسمح التصوير بالأشعة السينية اللينة بتصور توزيع المياه لشرائح الأقراص الخشبية بسبب شدة امتصاص الأشعة السينية التفاضلية للرطوبة في زيليم5و6. ومع ذلك، فإن هذه الأساليب لا توفر سوى مسارات لحركة المياه أو تبين توزيعات للمياه. في الآونة الأخيرة، تقنيات المراقبة غير المدمرة، مثل التركيز الدقيق بالأشعة السينية التصوير المقطعي (μCT)7و8و9و10والتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI)11، 12, وقد تحسنت بشكل كبير للسماح لمراقبة المياه في قنوات xylem داخل الشتلات سليمة. هذه الأساليب غير المدمرة لها مزايا كبيرة في أننا يمكن أن نلاحظ حالة المياه xylem دون آثار قطع الاصطناعية، ويمكننا تتبع ديناميات تدفق المياه عن طريق التصوير متتابعة أو إدخال عامل التباين10. ومع ذلك، نحن بحاجة إلى استخدام التصوير بالرنين المغناطيسي مخصصة للتصوير النباتي أو منشأة متخصصة لميكروكت القائم على سينكروترون من أجل الحصول على الصور التي يمكن تحديد محتوى المياه على مستوى الخلايا. وبالإضافة إلى ذلك، على الرغم من أن نظام ميكروكت القائم على سينكروترون تمكين للحصول على صور دقيقة مع دقة عالية المكانية، والتي هي مماثلة للميكروسكوب الضوئي7،8،9، يمكن أن يصاب الخلايا الحية من قبل إشعاع من الطاقة العالية الأشعة السينية13،14. استخدام المجهر الإلكتروني المسح التي يتم فيها تثبيت وحدات التبريد (cryo-SEM) هو طريقة مفيدة جدا لتحديد بدقة المياه في إكسيليم على المستوى الخلوي، على الرغم من أن هذا يتطلب حصاد المدمرة العينة للمراقبة. لإصلاح المياه في قنوات xylem، يتم تجميد جزء من ينبع (أي الأغصان، فروع أو ينبع) في الموقععن طريق النيتروجين السائل (LN 2). ملاحظات سطح العينات المقصوصة والمجمدة من قبل cryo-SEM توفر صوراً مكبرة للغاية لهيكل إكسيليم الذي يمكننا من خلاله تحديد المياه في قنوات إكسيليم كجليد. ومن القيود الهامة على هذه الطريقة أن المراقبة المتتابعة لقابلية نقل المياه داخل نفس العينة مستحيلة. ومع ذلك، فإن تطبيق التصوير بالرنين المغناطيسي أو التصوير بالرنين المغناطيسي للمراقبة المتتابعة للأشجار التي تعيش في حقل ما يشكل تحدياً كبيراً لأن هذه الأدوات ليست محمولة. وعلى النقيض من ذلك، فإن cryo-SEM لديه القدرة على استخدام هذه التقنية على الأشجار الكبيرة في التجارب الميدانية لتصور محتويات المياه بوضوح ليس فقط على المستوى الخلوي ولكن أيضا على مستوى بنية أدق، مثل المياه في الحفر بين الأوعية الدموية15،والمياه في المساحات بين الخلايا16، أو فقاعات في عمود المياه17.
وقد تم الإبلاغ عن العديد من الدراسات مراقبة المياه إكسيليم بواسطة CRYO-SEM 5،12،18،19،20،21،23. وقد أنشأ أوتسومي وآخرون (1996) في البداية بروتوكول اعادة النظر في حالة الزلمة في الموقع عن طريق تجميد تثبيت جذع حي عن طريق ملء LN2 في حاوية توضع على الجذع21. وحافظت درجة حرارة العينة على أقل من -20 درجة مئوية أثناء جمع العينات وأثناء تحضير الكريو -SEM من أجل تجنب ذوبان الجليد داخل قنوات إكسيليم. وقد استخدمت هذه الطريقة لمراقبة المياه في إكسيليم من أجل توضيح توزيع المياه في ظل تغيير نظام المياه11,12,24,25,26, 27,28, التغير الموسمي لتوزيع المياه21,29,30, تأثير دورات التجميد الذوبان17,31, 32, توزيع المياه في الخشب الرطب5, التغيرات في توزيع المياه خلال الانتقال من خشب السابود إلى خشب القلب20, الموسمية دورة من النشاط الكامبيال وتمايز السفن33, والتجويف الناجم عن بعض الضغوط الحيوية23،34. كما تم التحقق من التوصيل الهيدروليكي والقنوات الضعف إلى التجويف باستخدام CRYO-SEM35،36. وقد استخدم نظام Cryo-SEM المجهز بمطياف الأشعة السينية المشتت للطاقة (EDX أو EDS) لدراسة توزيع العناصر على سطح عينة تحتوي على الماء37.
تجميد تثبيت الجذع الحية التي تحتوي على قنوات تحت التوتر الهيدروليكي العالي يسبب أحيانا التجويف الاصطناعي التي لوحظت من قبل CRYO-SEM كما كسر بلورات الجليد في تجويف من القنوات38،39. وعلى وجه الخصوص، فإن الأنواع ذات الأوراق العريضة ذات القنوات الأطول والأوسع معرضة للقطع الأثرية الناجمة عنالتوتر، مثل التجويف الناجم عن قطع العينات، حتى لو أجريت تحت الماء 3،40. التجويف القطع الأثرية تصبح واضحة بعد أخذ العينات من شجرة تُحدث (أي أخذ العينات خلال النهار) أو في ظل ظروف الجفاف الشديد ويمكن أن تضلل إلى المبالغة في تقدير حدوث التجويف3,38, 39. ولذلك، فإن التوتر العمل في القنوات يجب أن يطلق سراحه منأجل تجنب التجويف artifactual 3،12،39.
وغالبا ما تستخدم تقنية تجميد الكسر باستخدام سكين مثبت في غرفة عينة لفضح سطح العينة للمراقبة cryo-SEM. ومع ذلك، تجميد كسر الطائرات من الأنسجة النباتية الخشبية، وخاصة المقاطع المستعرضة من xylem الثانوية، هي خشنة جدا لمراقبة بوضوح المعالم التشريحية والمياه في الأنسجة6. تطبيق كريوستات لتقليم عينة يسمح إعداد سريع وعالي الجودة من السطوح عينة20،23. والهدف العام من هذه الطريقة هو تقديم الأدلة مع دقة المجهر الإلكتروني لتوزيع المياه في أنواع مختلفة من خلايا إكسيليم في الموقع دون حدوث القطع الأثرية أخذ العينات. نحن نقدم لدينا إجراء تحديث، والتي تم تحسينها بشكل مطرد منذ اعتمدنا لأول مرة، فيما يتعلق بأخذ العينات، وتقليم وتنظيف سطح العينة للحصول على ميكروغرافات الإلكترون عالية الجودة من عينات cryo ثابت من xylem.
Protocol
Representative Results
Discussion
طرق المراقبة cryo-SEM التي أدخلت في هذه الورقة عملية لتصور واضح لتوزيع المياه على نطاق الخلوية. ومن خلال هذه الطريقة، يمكن أن يساعد استكشاف التغيرات في توزيع المياه داخل إكسيليم في توضيح آلية تحمل أنواع الأشجار للإجهاد غير الحيوي (نقص المياه أو تجميدها) أو الإجهاد الحيوي (مرض الشجرة).
<p class="jo…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل من قبل JSPS KAKENHI (رقم. 20120009, 20120010, 19780129, 25292110, 23780190, 232480222, 15H02450, 16H04936, 16H04948, 17H03825, 18H02258)
Materials
| coating material | JOEL Ltd., Japan | Gold wire, 0.50 × 1000 mm, 99.99 %, Parts No. 125000499 | |
| cryo scanning electron microscope | JOEL Ltd., Japan | JSM-6510 installed with MP-Z09085T / MP-51020ALS | |
| cryostat | Thermo Scientific | CryoStar NX70 | |
| microtome blade | Thermo Scientific | HP35 ULTRA Disposable Microtome Blades, 3153735 | |
| tissue freezing embedding medium | Thermo Scientific | Shandon Cryomatrix embedding resin, 6769006 |
References
- Tyree, M. T., Zimmermann, M. H. . Xylem structure and the ascent of sap. , (2002).
- Choat, B., Jansen, S., et al. Global convergence in the vulnerability of forests to drought. Nature. 491 (7426), 752-755 (2012).
- Klein, T., Zeppel, M. J. B., et al. Xylem embolism refilling and resilience against drought-induced mortality in woody plants: processes and trade-offs. Ecological Research. 33 (5), 839-855 (2018).
- Sano, Y., Okamura, Y., Utsumi, Y. Visualizing water-conduction pathways of living trees: selection of dyes and tissue preparation methods. Tree Physiology. 25 (3), 269-275 (2005).
- Sano, Y., Fujikawa, S., Fukazawa, K. Detection and features of wetwood in Quercusmongolica var. grosseserrata. Trees – Structure and Function. 9 (5), 261-268 (1995).
- Utsumi, Y., Sano, Y. Freeze stabilization and cryopreparation technique for visualizing the water distribution in woody tissues by X-ray imaging and cryo-scanning electron microscopy. Electron Microscopy. (Chapter 30), 677-688 (2014).
- Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Matthews, M. A., Shackel, K. A. The dynamics of embolism repair in xylem: in vivo visualizations using high-resolution computed tomography). Plant Physiology. 154 (3), 1088-1095 (2010).
- Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Lee, E. F., Shackel, K. A., Matthews, M. A. In vivo visualizations of drought-induced embolism spread in Vitis vinifera. Plant Physiology. 161 (4), 1820-1829 (2013).
- Choat, B., Badel, E., Burlett, R. E. G., Delzon, S., Cochard, H., Jansen, S. Noninvasive measurement of vulnerability to drought-induced embolism by X-ray microtomography. Plant Physiology. 170 (1), 273-282 (2016).
- Pratt, R. B., Jacobsen, A. L. Identifying which conduits are moving water in woody plants: a new HRCT-based method. Tree Physiology. 38 (8), 1200-1212 (2018).
- Fukuda, K., Kawaguchi, D., et al. Vulnerability to cavitation differs between current-year and older xylem: nondestructive observation with a compact MRI of two deciduous diffuse-porous species. Plant, Cell and Environment. 38 (12), 2508-2518 (2015).
- Ogasa, M. Y., Utsumi, Y., Miki, N. H., Yazaki, K., Fukuda, K. Cutting stems before relaxing xylem tension induces artefacts in Vitis coignetiae, as evidenced by magnetic resonance imaging. Plant, Cell and Environment. 39 (2), 329-337 (2016).
- Petruzzellis, F., Pagliarani, C., et al. The pitfalls of in vivo imaging techniques: evidence for cellular damage caused by synchrotron X-ray computed micro-tomography. New Phytologist. 220 (1), 104-110 (2018).
- Savi, T., Miotto, A., et al. Drought-induced embolism in stems of sunflower: A comparison of in vivo micro-CT observations and destructive hydraulic measurements. Plant Physiol Biochem. 120, 24-29 (2017).
- Choat, B., Jansen, S., Zwieniecki, M. A., Smets, E., Holbrook, N. M. Changes in pit membrane porosity due to deflection and stretching: the role of vestured pits. Journal of Experimental Botany. 55 (402), 1569-1575 (2004).
- Nakaba, S., Hirai, A., et al. Cavitation of intercellular spaces is critical to establishment of hydraulic properties of compression wood of Chamaecyparis obtusa seedlings. Annals of Botany. 117 (3), 457-463 (2016).
- Utsumi, Y., Sano, Y., Funada, R., Fujikawa, S., Ohtani, J. The progression of cavitation in earlywood vessels of Fraxinus mandshurica var japonica during freezing and thawing. Plant Physiology. 121 (3), 897-904 (1999).
- McCully, M., Canny, M. J., Huang, C. X. Cryo-scanning electron microscopy (CSEM) in the advancement of functional plant biology. Morphological and anatomical applications. Functional Plant Biology. 36 (2), 97-124 (2009).
- Canny, M. J. Vessel contents of leaves after excision – A test of Scholander’s assumption. American Journal of Botany. 84 (9), 1217-1222 (1997).
- Kuroda, K., Yamashita, K., Fujiwara, T. Cellular level observation of water loss and the refilling of tracheids in the xylem of Cryptomeria japonica during heartwood formation. Trees – Structure and Function. 23 (6), 1163-1172 (2009).
- Utsumi, Y., Sano, Y., Ohtani, J., Fujikawa, S. Seasonal changes in the distribution of water in the outer growth rings of Fraxinus mandshurica var. Japonica: A study by cryo-scanning electron microscopy. IAWA Journal. 17 (2), 113-124 (1996).
- Ohtani, J., Fujikawa, S. Cryo-SEM observations on vessel lumina of a living tree: Ulmus davidiana var. japonica. IAWA Journal. 11 (2), 183-194 (1990).
- Yazaki, K., Takanashi, T., et al. Pine wilt disease causes cavitation around the resin canals and irrecoverable xylem conduit dysfunction. Journal of Experimental Botany. 69 (3), 589-602 (2018).
- Tyree, M. T., Salleo, S., Nardini, A., Lo Gullo, M. A., Mosca, R. Refilling of embolized vessels in young stems of laurel. Do we need a new paradigm?. Plant Physiology. 120 (1), 11-21 (1999).
- Melcher, P. J., Goldstein, G., et al. Water relations of coastal and estuarine Rhizophora mangle: xylem pressure potential and dynamics of embolism formation. Oecologia. 126 (2), 182-192 (2001).
- Yazaki, K., Sano, Y., Fujikawa, S., Nakano, T., Ishida, A. Response to dehydration and irrigation in invasive and native saplings: osmotic adjustment versus leaf shedding. Tree Physiology. 30 (5), 597-607 (2010).
- Yazaki, K., Kuroda, K., et al. Recovery of physiological traits in saplings of invasive Bischofia tree compared with three species native to the Bonin Islands under successive drought and irrigation cycles. PLoS ONE. 10 (8), e0135117 (2015).
- Umebayashi, T., Morita, T., et al. Spatial distribution of xylem embolisms in the stems of Pinus thunbergii at the threshold of fatal drought stress. Tree Physiology. 36 (10), 1210-1218 (2016).
- Utsumi, Y., Sano, Y., Funada, R., Ohtani, J., Fujikawa, S. Seasonal and perennial changes in the distribution of water in the sapwood of conifers in a sub-frigid zone. Plant Physiology. 131 (4), 1826-1833 (2003).
- Utsumi, Y., Sano, Y., Fujikawa, S., Funada, R., Ohtani, J. Visualization of cavitated vessels in winter and refilled vessels in spring in diffuse-porous trees by cryo-scanning electron microscopy. Plant Physiology. 117 (4), 1463-1471 (1998).
- Ball, M. C., Canny, M. J., Huang, C. X., Egerton, J. J. G., Wolfe, J. Freeze/thaw-induced embolism depends on nadir temperature: the heterogeneous hydration hypothesis. Plant, Cell and Environment. 29 (5), 729-745 (2006).
- Mayr, S., Cochard, H., Ameglio, T., Kikuta, S. B. Embolism formation during freezing in the wood of Picea abies. Plant Physiology. 143 (1), 60-67 (2007).
- Kudo, K., Utsumi, Y., et al. Formation of new networks of earlywood vessels in seedlings of the deciduous ring-porous hardwood Quercus serrata in springtime. Trees – Structure and Function. 32 (3), 725-734 (2018).
- Crews, L., McCully, M., Canny, M. J., Huang, C., Ling, L. Xylem feeding by spittlebug nymphs: Some observations by optical and cryo-scanning electron microscopy. American Journal of Botany. 85 (4), 449-460 (1998).
- Hukin, D., Cochard, H., Dreyer, E., Le Thiec, D., Bogeat-Triboulot, M. B. Cavitation vulnerability in roots and shoots: does Populus euphratica Oliv., a poplar from arid areas of Central Asia, differ from other poplar species?. Journal of Experimental Botany. 56 (418), 2003-2010 (2005).
- Mayr, S., Cochard, H. A new method for vulnerability analysis of small xylem areas reveals that compression wood of Norway spruce has lower hydraulic safety than opposite wood. Plant, Cell and Environment. 26 (8), 1365-1371 (2003).
- Kuroda, K., Yamane, K., Itoh, Y. Cellular level in planta analysis of radial movement of artificially injected caesium in Cryptomeria japonica xylem. Trees – Structure and Function. 100 (8), 1-13 (2018).
- Cochard, H., Bodet, C., Ameglio, T., Cruiziat, P. Cryo-scanning electron microscopy observations of vessel content during transpiration in walnut petioles. Facts or artifacts?. Plant Physiology. 124 (3), 1191-1202 (2000).
- Umebayashi, T., Ogasa, M. Y., Miki, N. H., Utsumi, Y., Haishi, T., Fukuda, K. Freezing xylem conduits with liquid nitrogen creates artifactual embolisms in water-stressed broadleaf trees. Trees – Structure and Function. 30 (1), 305-316 (2016).
- Wheeler, J. K., Huggett, B., Tofte, A. N., Rockwell, F. E., Holbrook, N. M. Cutting xylem under tension or supersaturated with gas can generate PLC and the appearance of rapid recovery from embolism. Plant, Cell and Environment. 36 (11), 1938-1949 (2013).
- Canny, M. J., Huang, C. X. The cohesion theory debate continues. Trends In Plant Science. 6 (10), 454-456 (2001).
- Suuronen, J. -. P., Peura, M., Fagerstedt, K., Serimaa, R. Visualizing water-filled versus embolized status of xylem conduits by desktop x-ray microtomography. Plant Methods. 9 (1), 11 (2013).
