Distribuição da água de xylem em plantas lenhosas visualizadas com um microscópio de elétron da Cryo-exploração

Summary

Observar a distribuição de água dentro do xilema fornece informações significativas sobre a dinâmica do fluxo de água em plantas lenhosas. Neste estudo, demonstramos a abordagem prática para observar a distribuição de água de xilema in situ usando um criostat e Cryo-SEM, que elimina mudanças artifactuais no estado da água durante a preparação da amostra.

Abstract

Um microscópio eletrônico de varredura instalado crio-unidade (Cryo-SEM) permite a observação do espécime em temperaturas subzero e tem sido usado para explorar a distribuição de água em tecidos vegetais em combinação com técnicas de fixação de congelamento usando nitrogênio líquido (LN ₂). para espécies lenhosas, no entanto, os preparativos para a observação da superfície de corte transversal do xilema envolvem algumas dificuldades devido à orientação das fibras de madeira. Além disso, uma maior tensão na coluna de água em condutas de xilema pode ocasionalmente causar mudanças artifactuais na distribuição de água, especialmente durante a fixação e coleta da amostra. Neste estudo, demonstramos um procedimento eficiente para observar a distribuição de água dentro do xilema de plantas lenhosas in situ por meio de um criostat e Cryo-SEM. No início, durante a coleta da amostra, medir o potencial hídrico do xilema deve determinar se a alta tensão está presente nas condutas de xilema. Quando o potencial de água do xilema é baixo (< ca. − 0,5 MPa), é necessário um procedimento de relaxamento de tensão para facilitar a melhor preservação do estado da água em condutas de xilema durante a fixação do congelamento da amostra. Em seguida, um colarinho estanque é anexado ao redor do tronco de árvore e preenchido com LN₂ para fixação de congelamento do estado de água do xilema. Após a colheita, deve-se tomar cuidado para garantir que a amostra seja preservada congelada ao completar os procedimentos de preparo da amostra para observação. Um criostat é empregado para expor claramente a superfície transversal-cortada do xylem. Nas observações de Cryo-SEM, o ajuste de tempo para congelar-gravura é exigido para remover a poeira de geada e para acentuar a borda das paredes de pilha na superfície de visão. Nossos resultados demonstram a aplicabilidade de técnicas de Cryo-SEM para a observação da distribuição de água dentro do xilema em níveis celulares e subcelulares. A combinação de Cryo-SEM com técnicas de observação in situ não destrutivas melhorará profundamente a exploração da dinâmica de fluxo de água da planta lenhosa.

Introduction

A disponibilidade de recursos hídricos (i.e., precipitação, teor de água no solo) determina rigorosamente a mortalidade e a distribuição geográfica das espécies vegetais, uma vez que necessitam absorver água do solo e transportá-la para as folhas para produção fotossintética. As plantas devem manter seu sistema de transporte de água flutuação de abastecimento de água. Em particular, as plantas lenhosas geram altas tensões em suas condutas ao longo dos córregos de transpiração, pois, em alguns casos, eles precisam segurar sua coroa mais de ~ 100 m acima do solo. Para manter as colunas de água tal pressão negativa elevada, os condutas do xilem consistem em um continuum de pilhas tubulares com as paredes de pilha rígidas e hydrofóbicas-lignified¹. A vulnerabilidade à disfunção de xilema de condutas de xilema em cada espécie é um bom determinante da sobrevivência da espécie flutuação da água². Além disso, estudar o estado hídrico das condutas de xilema é importante para a avaliação do estado de saúde de árvores individuais submetidas a tensões abióticas ou bióticas. Medir o fluxo de SAP ou o potencial da água pode fornecer estimativas do status de água de uma planta lenhosa devido à função hidráulica integrada de conduits do xylem. Além disso, a visualização da distribuição de água em células de xilema pode esclarecer a condição de componentes individuais do sistema hidráulico xilema.

Existem várias técnicas para visualizar o estado hídrico das condutas de xilema³. Os métodos clássicos e úteis para observar as vias de água no tecido lenhoso envolvem manchar a coluna de água, imersando as extremidades dos ramos cortados em um corante ou injetando um corante em pé árvore hastes⁴. A fotografia de raio x suave também permite a visualização da distribuição de água de discos de madeira cortados devido à intensidade diferencial de absorção de raios-x da umidade em xilema^5,6. Estes métodos, entretanto, fornecem somente trilhas do movimento da água ou demonstram distribuições macroscópicas da água. Recentemente, técnicas de observação não destrutivas, como a tomografia computadorizada de raios X micro Focus (μct)^7,8,9,10e a ressonância magnética (RM)^{11, 12}, foram melhorados significativamente para permitir a observação da água em condutas do xylem dentro das mudas intactas. Estes métodos não destrutivos têm grandes vantagens em que podemos observar o estado de água do xilema sem efeitos de corte artificial, e podemos rastrear a dinâmica do fluxo de água por imagem seqüencial ou introduzindo um agente de contraste¹⁰. Entretanto, nós precisamos de usar um MRI personalizado para a imagem latente da planta ou uma facilidade especializada para o μCT Synchrotron-baseado a fim obter as imagens que podem identificar o índice de água do nível celular. Além disso, embora o sistema μct baseado em síncrotron possibilite a obtenção de imagens finas com alta resolução espacial, comparável à microscopia de luz^7,8,9, as células vivas podem ser feridas pelo radiação de raios-X de alta energia^13,14. Empregando um microscópio de elétron da exploração em que as Cryo-unidades são instaladas (Cryo-SEM) é um método muito útil para localizar precisamente a água no xilema a nível celular, embora isto exija destrutivamente colher a amostra para a observação. Para fixar a água em condutas de xilema, uma porção das hastes (ou seja, galhos, galhos ou hastes) é congelada in situ por nitrogênio líquido (LN₂). As observações da superfície de espécimes cortados, congelados por Cryo-sem fornecem imagens altamente amplificadas da estrutura do xilema de que nós podemos identificar a água em condutas do xylem como o gelo. Uma limitação significativa deste método é que a observação seqüencial da mobilidade da água dentro da mesma amostra é impossível. Entretanto, a aplicação de μCT ou de MRI para a observação seqüencial das árvores que vivem em um campo é extremamente desafiante porque estes instrumentos não são portáteis. Em contraste, Cryo-SEM tem um potencial para usar esta técnica em grandes árvores em experimentos de campo para visualizar claramente o conteúdo de água em não só o nível celular, mas também em um nível de estrutura mais fina, por exemplo, água em poços intervasculares¹⁵, água em espaços intercelulares¹⁶, ou bolhas na coluna de água¹⁷.

Muitos estudos observando a água de xylem por Cryo-sem foram relatados ^{5,12,18,19,20,21,23}. Utsumi et al. (1996) estabeleceram inicialmente o protocolo de observação do xilema in situ por congelamento-fixação de um tronco vivo através do preenchimento do LN₂ em um recipiente fixado na haste²¹. A temperatura da amostra foi mantida abaixo de-20 ° c durante a coleta da amostra e durante a preparação de Cryo-SEM, a fim de evitar derreter o gelo dentro de condutas de xilema. Este método tem sido usado para observar a água em xilema, a fim de esclarecer a distribuição de água o regime de água em mudança¹¹,^{12,24,25,26, 27,28}, a variação sazonal da distribuição de água²¹,²⁹,³⁰, o efeito dos ciclos de congelação-descongelamento^{17,31, 32}, a distribuição da água na madeira molhada⁵, mudanças na distribuição da água durante a transição do alburno ao cerne²⁰, curso de tempo sazonal da atividade cambial e diferenciação dos navios³³, e cavitação induzida por determinadas tensões bióticas^23,34. A condutividade hidráulica e a vulnerabilidade de condutas à cavitação também foram verificadas usando Cryo-sem^35,36. Cryo-SEM equipado com a espectrometria de raio X dispersiva da energia (EDX ou EDS) foi usado para estudar a distribuição do elemento sobre a superfície de um espécime que contem a água³⁷.

Congelar-fixação de um tronco vivo que contenha condutas a tensão hidráulica elevada provoca às vezes cavitações artificiais que são observados pelo Cryo-sem como cristais de gelo fraturados no lúmen das condutas^38,39. Em particular, as espécies Latifoliada com condutas mais longos e mais largos são vulneráveis aos artefatos tensão-induzidos, tais como a cavitação causada pelo corte da amostra, mesmo se conduzido a água^3,40. Os artefatos de cavitação tornam-se evidentes após a amostragem de uma árvore transpiring (ou seja, amostragem durante o dia) ou condições severas de seca e podem induzir em erro a uma superestimação da ocorrência de cavitação^{3,38, 39}. Portanto, a tensão que trabalha nas condutas tem de ser liberada a fim de evitar a cavitação vesícula^3,12,39.

A técnica da congelar-fratura usando uma faca instalada em uma câmara do espécime é empregada frequentemente para expor a superfície do espécime para a observação de Cryo-SEM. Entretanto, os planos liofilizados de tecidos de plantas lenhosas, especialmente seções transversais do xilema secundário, são muito ásperos para observar claramente as características anatômicas e a água no tecido⁶. A aplicação de um criostat para aparar um espécime permite a preparação rápida e de alta qualidade de superfícies da amostra^20,23. O objetivo geral deste método é fornecer a evidência com a definição da microscopia de elétron da distribuição da água em vários tipos de pilhas do xylem in situ sem a ocorrência de Artifacts da amostragem. Nós introduzimos nosso procedimento actualizado, que foi melhorado firmemente desde que nós o adotamos primeiramente, a respeito da amostragem, do aparamento e da limpeza da superfície do espécime para obter micrografias de elétron de alta qualidade de amostras Cryo-fixas do xilema.

Protocol

Nota: um gráfico esquemático deste protocolo é mostrado na Figura 1. 1. amostragem: abrandamento da tensão dentro da coluna da água de conduits de xylem Nota: o tratamento de relaxamento de tensão a seguir é recomendado antes da aplicação LN2 para evitar os artefatos de congelamento e tensão induzida na distribuição de água do xilema. Coloque uma ramificação e folhas para amostragem com um saco plást…

Representative Results

Imagens representativas de superfícies de corte transversal de xilema de árvores coníferas e Latifoliada, observadas por Cryo-sem, são mostradas na Figura 2. Na baixa ampliação, a área preta nas imagens indica as cavidades de que a água desaparece inteiramente ou em parte, e a área cinzenta indica as paredes de pilha do xylem, o citoplasma, e a água (Figura 2a). Na ampliação elevada, é evidente que a…

Discussion

Os métodos de observação de Cryo-SEM introduzidos neste trabalho são práticos para a visualização clara da distribuição de água em uma escala celular. Através deste método, explorando as mudanças na distribuição de água dentro do xilema pode potencialmente ajudar a esclarecer o mecanismo de tolerância de espécies de árvores ao estresse abiótico (escassez de água ou congelamento) ou estresse biótico (doença da árvore).

O passo mais crucial neste método é preservar a di…

Materials

coating material	JOEL Ltd., Japan	Gold wire, 0.50 × 1000 mm, 99.99 %, Parts No. 125000499
cryo scanning electron microscope	JOEL Ltd., Japan	JSM-6510 installed with MP-Z09085T / MP-51020ALS
cryostat	Thermo Scientific	CryoStar NX70
microtome blade	Thermo Scientific	HP35 ULTRA Disposable Microtome Blades, 3153735
tissue freezing embedding medium	Thermo Scientific	Shandon Cryomatrix embedding resin, 6769006