극저온 스캐닝 전자 현미경으로 시각화된 우디 식물의 자일렘 물 분포

Summary

xylem 내의 물 분포를 관찰하면 우디 식물의 물 흐름 역학에 관한 중요한 정보를 제공합니다. 이 연구에서는 시료 준비 중 물 상태의 실제 적 변화를 제거하는 저온 유지 및 저온 SEM을 사용하여 현장에서 자일렘 물 분포를 관찰하는 실용적인 접근 법을 보여줍니다.

Abstract

스캐닝 전자 현미경 설치 저온 장치(cryo-SEM)는 영하의 온도에서 시편 관찰을 가능하게 하며 액체 질소(LN)를 _{이용한 동결 고정 기술과 함께 식물 조직의 물 분포를 탐색하는 데 사용되어 왔습니다.} 2). 우디 종의 경우, xylem 가로 절단 표면을 관찰하기위한 준비는 나무 섬유의 배향으로 인해 몇 가지 어려움을 수반한다. 또한, 자일렘 도관의 물 기둥의 높은 장력은 특히 샘플 고정 및 수집 중에 물 분포에 예술적 변화를 일으킬 수 있습니다. 본 연구에서, 우리는 저온 극저온 및 저온 -SEM을 사용하여 현장에서 우디 식물의 자일렘 내에서 물 분포를 관찰하는 효율적인 절차를 입증한다. 처음에, 샘플 수집 하는 동안, 자일렘 물 전위를 측정 하는 높은 장력이 자일렘 도관에 존재 여부를 결정 한다. 자일렘 물 전위가 낮을 때(ca. -0.5 MPa), 시료 동결 고정 중에 자일렘 도관에서 물 상태를 더 잘 보존하기 위해 장력 완화 절차가 필요합니다. 다음으로, 나무 줄기 주위에 방수 칼라가 부착되고 자일렘의 물 상태의 동결 고정을 위해 LN 2로 채워져 있습니다. 수확 후, 관찰을위한 샘플 준비 절차를 완료하는 동안 샘플이 동결 보존되도록주의를 기울여야합니다. 실렘 가로 절단 표면을 명확하게 노출시키기 위해 저온 극저온이 사용됩니다. 저온-SEM 관측에서, 동결 에칭을 위한 시간 조정은 서리 먼지를 제거하고 보기 표면에 세포벽의 가장자리를 강조하기 위하여 요구됩니다. 우리의 결과는 세포 및 세포 이하 수준에서 자일렘 내의 물 분포의 관찰을 위한 저온-SEM 기술의 적용성을 보여줍니다. 극저온-SEM과 비파괴적 관측 기법의 조합은 우디 식물의 물 흐름 역학의 탐사를 심오하게 향상시킬 것입니다.

Introduction

수자원의 가용성 (즉, 강수량, 토양 수분 함량)은 토양에서 물을 흡수하고 광합성 생산을 위해 잎으로 운반해야하기 때문에 식물 종의 사망률과 지리적 분포를 엄격하게 결정합니다. 플랜트는 변동하는 물 공급 하에서 물 수송 시스템을 유지해야 합니다. 특히, 우디 식물은 증발 스트림을 따라 자신의 도관에 높은 장력을 생성, 어떤 경우에는, 그들은 지상 ~ 100m 이상 자신의 크라운을 개최해야합니다. 이러한 높은 음압 하에서 물 기둥을 유지하기 위해 자일렘 도관은 단단하고 소수성 결찰 된 세포벽^1을가진 관형 세포의 연속체로 구성됩니다. 각 종에서 자일렘 도관의 자일렘 기능 장애에 대한 취약성은 변동하는 물 공급 하에서종 생존의 좋은 결정자이다 2. 또한, 자일렘 도관의 물 상태를 연구하는 것은 비생물성 또는 생체 학적 응력을 받는 개별 나무의 건강 상태를 평가하는 데 중요합니다. 수액 유량 또는 물 전위를 측정하면 자일렘 도관의 통합 유압 기능으로 인해 우디 플랜트의 물 상태를 추정할 수 있습니다. 또한, 자일렘 셀에서 물의 분포를 시각화하면 자일렘 유압 시스템의 개별 구성 요소의 상태를 명확히 할 수 있습니다.

자일렘 도관의 물 상태를 시각화하기위한 몇 가지 기술이 존재³. 우디 조직에서 물 통로를 관찰하기위한 고전적이고 유용한 방법은 염색에 절단 가지의 끝을 침지하거나 서있는 나무 줄기에 염료를 주입하여 물 기둥을 염색하는 것을 포함한다^4. 소프트 엑스레이 사진은 또한 xylem^5,6의수분의 차동 X 선 흡수 강도로 인해 슬라이스 된 나무 디스크의 물 분포를 시각화 할 수 있습니다. 그러나 이러한 방법은 물의 움직임만을 제공하거나 물의 거시적 분포를 보여줍니다. 최근에는 마이크로 포커스 X선 컴퓨터 단층 촬영(μCT) 7,^8,9,10및 자기 공명 영상(MRI)^11과 같은 비파괴 관찰 기술 ^도12는, 그대로 의 묘목 내에서 자일렘 도관에서 물의 관찰을 허용하도록 크게 개선되었다. 이러한 비파괴적 방법은 인공 절단 효과 없이 자일렘의 수상태를 관찰할 수 있고, 순차적 이미징 또는 조영제(10)를 도입하여 물 흐름 역학을 추적할 수 있다는 점에서 큰 장점이 있다. 그러나, 우리는 세포 수준 수분 함량을 확인할 수 있는 심상을 얻기 위하여 식물 화상 진찰을 위한 주문을 받아서 만들어진 MRI 또는 싱크로트론 기지를 둔 μCT를 위한 전문화한 시설을 사용할 필요가 있습니다. 또한, 싱크로트론 기반 μCT 시스템은 광 현미경 7,^8,9에필적하는 높은 공간 해상도로 미세한 이미지를 얻을 수 있지만, 살아있는 세포는 고에너지 X 선^13,14의방사선 . 저온 단위가 설치되는 주사 전자 현미경 (cryo-SEM)을 사용하는 것은 관찰을 위해 샘플을 파괴적으로 수확해야하지만 세포 수준에서 자일렘에서 물을 정확하게 찾는 데 매우 유용한 방법입니다. 자일렘 도관에 물을 고정하기 위해, 줄기의 일부 (즉, 나뭇 가지, 가지 또는 줄기)는 액체 질소 (LN 2)에 의해 그 자체로 동결된다. 저온-SEM에 의해 트리밍, 냉동 표본의 표면의 관측은 우리가 얼음으로 자일렘 도관에서 물을 식별 할 수있는 자일렘 구조의 고도로 확대 된 이미지를 제공합니다. 이 방법의 현저한 한계는 동일한 샘플 내에서 물 이동성의 순차적 관찰이 불가능하다는 것입니다. 그러나, 이러한 기기는 휴대용이 아니기 때문에 필드에 살고있는 나무의 순차적 관찰을위한 μCT 또는 MRI의 적용은 매우 도전적이다. 대조적으로, cryo-SEM은 세포 수준뿐만 아니라 더 미세한 구조 수준(예: 혈관 간 구덩이^15,물)에서 수분 함량을 명확하게 시각화하기 위해 현장 실험에서 큰 나무에 이 기술을 사용할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 세포간 공간^16,또는 물 열^(17)의거품.

저온-SEM에 의한 자일렘물을 관찰하는 많은 연구가 ^{5,12,18,19,20,21,23으로}보고되었다. Utsumi et al. (1996)은 처음에 LN 2를 스템(21)에 설정된 용기에 채우는 것을 통해 살아있는 트렁크의 동결 고정에 의해 소자렘의 관찰을 위한 프로토콜을 확립하였다. 시료의 온도는 자일렘 도관 내에서 얼음이 녹는 것을 피하기 위해 시료 수집 및 냉동-SEM 준비 동안 -20°C 이하로 유지되었다. 이 방법은 변화하는 물 정권^{11,12,24,25,26,}변화 하의 물 분포를 명확히하기 위해 실렘에서 물을 관찰하는 데사용되었습니다. ^27,28,물 분포의 계절 변화^21,29,30,동결 해동 주기의 효과^{17,31, 32,}젖은 나무5에있는 물의 분포, 수액에서 하트우드(20)로의 전환 시 물 분포의 변화, 암비 활동및 선박의 분화의 계절적 시간^과정(33) 및 특정 생체 스트레스에 의해 유도 된 캐비테이션^23,34. 캐비테이션에 대한 유압 전도도 및 도관 취약성도 저온-SEM^35,36을사용하여 검증되었습니다. 에너지 분산X선분광법(EDX 또는 EDS)을 구비한 극저온-SEM은 물(37)을 함유하는 시편의표면에 대한 원소 분포를 연구하는데 사용되어 왔다.

높은 유압 장력 하에서 도관을 포함하는 살아있는 트렁크의 동결 고정은 때때로 도관^38,39의내강에서 골절 된 얼음 결정으로 극저온 -SEM에 의해 관찰되는 인공 캐비테이션을 유발합니다. 특히, 더 길고 넓은 도관을 가진 광엽종은 수중^에서실시하더라도 시료 절단에 의한 캐비테이션과 같은 장력 유발 아티팩트에 취약하다. 캐비테이션 아티팩트는 발생하는 나무 (즉, 낮 동안 샘플링) 또는 심한 가뭄 조건에서 샘플링 한 후 눈에 띄게되며 캐비테이션 발생 3,^38의과대 평가로 이어질 수 있습니다. ³⁹. 따라서, 도관에서 작동하는 장력은 예술적 캐비테이션^3,12,39를피하기 위해 방출되어야한다.

시편 챔버에 설치된 칼을 사용하는 동결 파괴 기술은 종종 저온 -SEM 관찰을위해 시편 표면을 노출하는 데 사용됩니다. 그러나, 우디 식물 조직의 동결 골절 평면, 특히 보조 자일렘의 횡절편은 조직 내의 해부학적 특징과물을 명확하게 관찰하기에는 너무 거칠다 6. 시편을 다듬기위한 저온 극저온의 응용 프로그램은 샘플 표면^(20,23)의신속하고 고품질의 준비를 할 수 있습니다. 이 방법의 전반적인 목표는 샘플링 아티팩트의 발생없이 현장에서 다양한 종류의 자일렘 세포에서 물 분포의 전자 현미경 해상도를 제공하는 것입니다. 우리는 자일렘의 고품질 전자 현미경 을 얻기 위한 표본 표면의 샘플링, 트리밍 및 세척과 관련하여 처음 채택된 이래로 꾸준히 개선된 업데이트된 절차를 소개합니다.

Protocol

참고: 이 프로토콜의 회로도 차트는 그림1에 나와 있습니다. 1. 샘플링 : 자일렘 도관의 물 기둥 내에서 긴장 완화 참고: 다음 장력 이완 처리는 LN2 적용 전에 실렘 물 분포에서 동결 및 장력 유도 아티팩트를 모두 피하기 위해 권장됩니다. 분기를 동봉하고 자일렘과 샘플링 하기 전에 2 시간 이상 잎 사이의 물 잠재력을…

Representative Results

극저온-SEM에 의해 관찰된 응비및 활엽수 자일렘의 가로 절단 표면의 대표적인 이미지는 그림2에 나와 있다. 낮은 배율에서 이미지의 검은 영역은 물이 완전히 또는 부분적으로 사라지는 구멍을 나타내고 회색 영역은 자일렘 세포벽, 세포질 및 물을 나타냅니다(그림2A). 높은 배율에서, 물은 3개의 기관지의 루미나로…

Discussion

이 백서에 소개된 극저온-SEM 관찰 방법은 세포 규모의 물 분포를 명확하게 시각화하는 데 실용적입니다. 이 방법을 통해 자일렘 내의 물 분포의 변화를 탐구하는 것은 잠재적으로 비생물적 스트레스 (물 부족 또는 동결) 또는 생물학적 스트레스 (나무 질병)에 대한 수종 내성의 메커니즘을 명확히하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 방법의 가장 중요한 단계는 샘플 수집 및 후?…

Materials

coating material	JOEL Ltd., Japan	Gold wire, 0.50 × 1000 mm, 99.99 %, Parts No. 125000499
cryo scanning electron microscope	JOEL Ltd., Japan	JSM-6510 installed with MP-Z09085T / MP-51020ALS
cryostat	Thermo Scientific	CryoStar NX70
microtome blade	Thermo Scientific	HP35 ULTRA Disposable Microtome Blades, 3153735
tissue freezing embedding medium	Thermo Scientific	Shandon Cryomatrix embedding resin, 6769006