Xylem vatten distribution i Woody växter visualiseras med en Cryo-scanning Electron Mikroskop

Summary

Observation av vatten distributionen inom Xylem ger viktig information om vattenflödesdynamik i vedartade växter. I denna studie visar vi den praktiska metoden för att observera Xylem vatten distribution in situ genom att använda en kryostat och Cryo-SEM, vilket eliminerar artifaktuella förändringar i vatten status under prov beredning.

Abstract

Ett svep elektron Mikroskop installerat Cryo-Unit (Cryo-SEM) tillåter preparat observation vid minus grader och har använts för att undersöka vatten distribution i växt vävnader i kombination med frys bindnings teknik med flytande kväve (LN ₂). för Woody arter, dock preparat för observation av Xylem tvärgående yta innebära vissa svårigheter på grund av orientering av trä fibrer. Dessutom kan högre spänningar i vattenpelare i Xylem ledningar ibland orsaka artefakt förändringar i vatten distribution, särskilt under prov fixering och insamling. I denna studie visar vi ett effektivt förfarande för att observera vatten distributionen inom Xylem av vedartade växter på plats genom att använda en kryostat och Cryo-SEM. Vid första, under prov insamling, mätning av Xylem vattenpotentialen bör avgöra om hög spänning är närvarande i Xylem conduits. När Xylem vattenpotentialen är låg (< ca. − 0,5 MPa), en spänning avslappnings förfarande behövs för att under lätta bättre bevarande av vatten status i Xylem ledningar under provet frysa fixering. Därefter fästs en vatten tät krage runt träd stammen och fylls med LN₂ för frys fixering av XYLEMS vatten status. Efter skörd skall försiktighet iakttas för att säkerställa att provet bevaras fryst medan förfarandet för prov beredning för observation är slutfört. Kryostat används för att tydligt exponera den tvärgående ytan av Xylem. I Cryo-SEM observationer krävs tids justering för frysning-etsning för att ta bort frost damm och accentuera kanten av cell väggarna på utsikts ytan. Våra resultat visar tillämpligheten av Cryo-SEM tekniker för observation av vatten distribution inom Xylem på cellulär och subcellulär nivå. Kombinationen av Cryo-SEM med icke-förstörande in situ observation tekniker kommer att grundligt förbättra utforskandet av vedartade växtvattenflödesdynamik.

Introduction

Till gången på vatten resurser (dvs. nederbörd, mark vatten halt) bestämmer strängt dödligheten och den geografiska fördelningen av växt arter, eftersom de måste absorbera vatten från marken och transportera det till bladen för foto syntetisk produktion. Anläggningarna måste bibehålla sitt vatten transport system under fluktuerande vatten leveranser. I synnerhet vedartade växter genererar höga spänningar i sina ledningar längs transpiration strömmar som, i vissa fall, de behöver för att hålla sin krona mer än ~ 100 m ovan jord. För att bibehålla vattenpelare under så högt negativt tryck består Xylem-conduits av ett kontinuum av tubulära celler med stela och hydrofoba-lignifierade cell väggar¹. Den sårbarhet för Xylem dysfunktion av Xylem conduits i varje art är en bra avgörande av arten överlevnad under fluktuerande vattenförsörjning². Dessutom är det viktigt att studera vatten status av Xylem conduits för utvärdering av hälso tillståndet hos enskilda träd som utsätts för abiotiska eller biotiska påfrestningar. Mätning SAP flöde eller vattenpotential kan ge uppskattningar av en Woody anläggningens vatten status på grund av den integrerade hydrauliska funktionen av Xylem conduits. Dessutom kan visualisering av vatten distributionen i Xylem-celler klargöra tillståndet för enskilda komponenter i XYLEMS hydraul system.

Flera tekniker för att visualisera vatten status av Xylem conduits finns³. Den klassiska och användbara metoder för observation av vatten vägar i vedartade vävnad innebär färgning av vattenpelaren genom att doppa ändarna av skurna grenar i ett färg ämne eller genom att injicera ett färg ämne i stående träd stammar⁴. Mjuk röntgen fotografering gör det också möjligt visualisering av vatten distribution av skivade trä skivor på grund av den differentiella x-ray absorptionsintensiteten av fukten i Xylem^5,6. Dessa metoder, dock endast ge spår av vatten rörelse eller demonstrera makroskopiska distributioner av vatten. Nyligen, icke-förstörande observation tekniker, såsom Micro Focus X-ray datortomografi (μct)^7,8,9,10och magnetisk resonanstomografi (MRI)^{11, 12}, har förbättrats avsevärt för att möjliggöra observation av vatten i Xylem ledningar inom intakt plantor. Dessa icke-destruktiva metoder har stora fördelar i att vi kan observera XYLEMS vatten status utan konstgjorda skär effekter, och vi kan spåra vattenflödet dynamik genom sekventiell avbildning eller införa ett kontrast medel¹⁰. Vi måste dock använda en anpassad MRI för växt avbildning eller en specialiserad anläggning för synkrotronbaserad μCT för att erhålla de bilder som kan identifiera vattenhalten i cell nivå. Dessutom, även om synkrotron-baserade μct-systemet är aktiverat för att erhålla fina bilder med hög rumslig upplösning, vilket är jämförbart med ljusmikroskopi^7,8,9, kan levande celler skadas av strålning av hög energi röntgen,^13,14. Använda ett svep elektron Mikroskop där Cryo-enheter är installerade (Cryo-SEM) är en mycket användbar metod för att exakt lokalisera vattnet i Xylem på cell nivå, även om detta kräver destruktivt skörd provet för observation. För att fixera vattnet i XYLEMS ledningar är en del av stjälkarna (dvs. kvistar, grenar eller stammar) frysta in situ av flytande kväve (LN₂). Observationer av ytan av trimmade, frysta exemplar av Cryo-SEM ger mycket förstorade bilder av Xylem struktur som vi kan identifiera vattnet i Xylem ledningar som is. En betydande begränsning av denna metod är att sekventiell observation av vattnets movabilitet inom samma prov är omöjlig. Tillämpningen av μCT eller MRI för sekventiell observation av träd som lever i ett fält är dock extremt utmanande eftersom dessa instrument inte är portabla. I motsats, Cryo-SEM har en potential för att använda denna teknik på stora träd i fält experiment för att tydligt visualisera vatten innehåll på inte bara cell nivå utan också på en finare struktur nivå, e.g., vatten i intervascular gropar¹⁵, vatten i intercellulära utrymmen¹⁶, eller bubblor i vatten kolumn¹⁷.

Många studier som observerar Xylem Water av Cryo-SEM har rapporter ATS ^{5,12,18,19,20,21,23}. Utsumi et al. (1996) upprättade inlednings vis protokollet för observation av Xylem in situ genom frysning-fixering av en levande stam genom att fylla LN₂ i en behållare inställd på stammen²¹. Temperaturen på provet bibehölls under-20 ° c under provtagning och under Cryo-SEM beredning för att undvika smältande is inom Xylem-ledningar. Denna metod har använts för att observera vattnet i Xylem för att klargöra vatten distributionen under förändrade vatten system^{11,12,24,25,26, 27,28}, den säsongsbetingade variationen i vatten^{distribution 21,29,30}, effekten av frys-tö cykler^{17,31, 32}, fördelningen av vatten i vått trä⁵, förändringar i vatten fördelningen under över gången från sapwood till kärnved²⁰, säsongsbunden tid av kambial aktivitet och differentiering av fartyg³³, och kavitation induceras av vissa biotiska spänningar^23,34. Hydraulisk konduktivitet och conduits sårbarhet för kavitation har också verifierats med Cryo-SEM^35,36. Cryo-SEM utrustad med energidispersiv röntgenspektrometri (EDX eller EDS) har använts för att studera elementets fördelning över ytan av ett prov som innehåller vatten³⁷.

Frysning-fixering av en levande stam som innehåller ledningar under hög hydraulisk spänning orsakar ibland konstgjorda kavitation som observeras av Cryo-SEM som brutna iskristaller i lumen av conduits^38,39. I synnerhet, ädel löv arter med längre och bredare ledningar är sårbara för spännings-inducerad artefakter, såsom kavitation orsakad av provtagning, även om den utförs under vatten^3,40. Kavitation artefakter blir iögonfallande efter provtagning av ett transpiring träd (dvs provtagning under dagtid) eller under svåra tork förhållanden och de kan vilseleda till en överskattning av kavitation förekomst^3,38, på ³⁹. Därför måste spänningen som arbetar i ledningarna släppas för att undvika den artifaktuella kavitation^3,12,39.

Frys fraktur tekniken med hjälp av en kniv monterad i en preparat kammare används ofta för att exponera preparat ytan för Cryo-SEM-observation. Men frysa-Fractured plan av vedartade växt vävnader, särskilt tvärgående delar av sekundära Xylem, är för grova för att tydligt observera de anatomiska egenskaper och vatten i vävnaden⁶. Användning av kryostat för att trimma ett preparat möjliggör snabb och högkvalitativ beredning av prov ytorna^20,23. Det övergripande målet med denna metod är att ge bevis med elektronmikroskopi upplösning av vatten distributionen i olika typer av Xylem celler in situ utan förekomst av provtagning artefakter. Vi introducerar vårt uppdaterade förfarande, som har förbättrats stadigt sedan vi först antog det, om provtagning, putsning och rengöring av preparat ytan för att erhålla högkvalitativa elektronmikrografer av Cryo-fasta prover av Xylem.

Protocol

Obs: en schematisk tabell över detta protokoll visas i figur 1. 1. provtagning: spänning avslappning inom Water Column av Xylem conduits Anmärkning: följande spänning avslappnings behandling rekommenderas innan LN2 ansökan för att undvika både frysning och spänningar-inducerad artefakter i Xylem vatten distribution. Bifoga en gren och blad för provtagning med en svart plast påse för att jämvikt vattenpo…

Representative Results

Representativa bilder av tvärskurna ytor av barr-och lövträd Xylem, observerade av Cryo-SEM, visas i figur 2. Vid låg förstoring indikerar det svarta området i bilderna håligheter från vilka vatten helt eller delvis försvinner, och det gråa området indikerar XYLEMS cell väggar, cytoplasman och vatten (figur 2a). Vid hög förstoring, är det uppenbart att vattnet inte är helt förlorad från Lumina a…

Discussion

Den Cryo-SEM observations metoder som införts i detta dokument är praktiska för att tydligt visualisera vatten distribution på cellulär skala. Genom denna metod, utforska förändringar i distributionen av vatten inom Xylem kan potentiellt bidra till att klargöra mekanismen för trädslag tolerans mot abiotisk stress (vatten brist eller frysning) eller biotiska stress (träd sjukdom).

Det mest avgörande steget i denna metod är att bevara vatten distributionen som kännetecknar den ursp…

Materials

coating material	JOEL Ltd., Japan	Gold wire, 0.50 × 1000 mm, 99.99 %, Parts No. 125000499
cryo scanning electron microscope	JOEL Ltd., Japan	JSM-6510 installed with MP-Z09085T / MP-51020ALS
cryostat	Thermo Scientific	CryoStar NX70
microtome blade	Thermo Scientific	HP35 ULTRA Disposable Microtome Blades, 3153735
tissue freezing embedding medium	Thermo Scientific	Shandon Cryomatrix embedding resin, 6769006