Summary

Hæmning af Aspergillus flavus vækst og aflatoksin produktion transgene majs udtrykker α-amylase hæmmer fra hjelmbønne purpureus L.

Published: February 15, 2019
doi:

Summary

Her præsenterer vi en protokol for at analysere Aspergillus flavus vækst og aflatoksin produktion i majs kerner udtrykker en svampedræbende protein.  Ved hjælp af en normal god landbrugspraksis-udtrykker A. flavus stamme overvåges vi af infektion og spredning af svamp i modne kerner i realtid. Analysen er hurtig, pålidelig og reproducerbar.

Abstract

Aflatoksinforureningen i fødevare-og er en stor udfordring på verdensplan. Aflatoksiner, produceret af svampen Aspergillus flavus (A. flavus) er potent kræftfremkaldende, der væsentligt reducerer afgrøde værdi i majs og andre olie rig afgrøder som peanut udover alvorlig trussel for menneskers og dyrs sundhed. Forskellige metoder, herunder traditionelle avl, transgene udtryk for modstand knyttet proteiner og RNA-interferens (RNAi)-baseret vært-induceret genhæmning af kritiske A. flavus gen målene, evalueres for at øge aflatoksin modstand i modtagelige afgrøder. Tidligere undersøgelser har vist en vigtig rolle i α-amylase i A. flavus patogenese og aflatoksin produktion, tyder dette gen/enzym er et potentielt mål at reducere både A. flavus vækst og aflatoksin produktion. I denne forbindelse den aktuelle undersøgelse var forpligtet sig til at evaluere Heterolog ekspression (under kontrol af konstitutiv CaMV 35S -promotoren) af en hjelmbønne purpureus L. α-amylase inhibitor-lignende protein (AILP) i majs mod A. flavus. AILP er en 36-kDa protein, som er en kompetitiv inhibitor af A. flavus α-amylase enzym og tilhører lektin-arcelin-α-amylase inhibitor protein familie i fælles bønne. In vitro undersøgelser forud for det aktuelle arbejde havde vist AILP rolle i hæmning af A. flavus α-amylase aktivitet og svampevækst. Svampevækst og aflatoksin produktion i modne kerner blev overvåget i realtid ved hjælp af en normal god landbrugspraksis-udtrykker A. flavus stamme. Denne kerne screening assay (KSA) er meget enkel at sætte op og giver pålidelig og reproducerbar data på infektion og omfanget af spredning, der kunne kvantificeres for evalueringen af kimplasma og transgene linjer. Fluorescens fra stammen, normal god landbrugspraksis er tæt korreleret til svampe vækst, og i forlængelse heraf er det godt korreleret til aflatoksin værdier.  Målet med den nuværende arbejde var at gennemføre denne tidligere viden i et kommercielt vigtige afgrøder som majs til at øge aflatoksin modstand. Vores resultater viser en 35% – 72% reduktion i A. flavus vækst i AILP-udtrykker transgene majs kerner, som til gengæld oversat til en 62-88% reduktion i aflatoksinindholdet.

Introduction

Mykotoksin kontaminering af svampe slægterne, Aspergillus, Fusarium, Penicilliumog Alternaria er et stort problem for fødevarer og foder afgrøder, der dyrkes på verdensplan1,2,3. Blandt disse plantepatogene svampe har Aspergillus den største skadelige indvirkning på afgrøde værdi og menneskers og dyrs sundhed. Aspergillus flavus (A. flavus) er en opportunistisk plante-patogen, der inficerer olie rig afgrøder såsom majs, bomuldsfrø og peanut og producerer de potent kræftfremkaldende stoffer, aflatoksiner, samt talrige giftige sekundære metabolitter (SMs). Majs er en vigtig fødevare og fodre afgrøder dyrkes på verdensplan og er meget modtagelige for forurening af A. flavus. De økonomiske konsekvenser af Aflatoksinforureningen på mister og reducerede værdi i majs kan være så meget som $686.6 mio i USA2 med forventede ændringer i globale klima, virkningen af aflatoksiner kunne resultere i større økonomiske tab i majs med skøn så højt som $1,68 milliarder pr. år i den i nærheden af fremtidige2. I betragtning af de negative økonomiske og sundhedsmæssige virkninger af aflatoksiner i mennesker og husdyr, kunne før høst aflatoksin kontrol i majs være den mest effektive måde at forhindre aflatoksinindholdet i levnedsmidler og foder produkter.

Den store før høst kontrol tilgang til aflatoksin resistens i majs, som har været udbredt i de seneste årtier er primært gennem avl, som kræver en betydelig mængde tid4. For nylig, biocontrol har haft en vis succes i aflatoksin reduktion i stor skala felt programmer5,6. Udover biocontrol, har anvendelse af avanceret Molekylær værktøjer såsom ‘Vært induceret genhæmning’ (HIGS) gennem RNAi og transgene udtryk for modstand-associerede proteiner haft en vis succes i reduktion af A. flavus vækst og aflatoksin produktion i lille målestok laboratorie- og undersøgelser. Disse tilgange er i øjeblikket ved at blive optimeret udover at identificere nye potentielle A. flavus gen mål for fremtidige manipulation.

Udover gener, der er direkte involveret i mykotoksin produktion som potentielle mål af transgene kontrolstrategier, har svampe amylaser vist sig at spille en afgørende rolle i at opretholde vellykket patogenese og mykotoksin produktion under vorden af værten plante infektion. Et par eksempler kan nævnes Pythium pleroticum (kausal agent af ingefær rhizom rot), Fusarium solani (kausal agent af blomkål visnesyge), hvor positive korrelationer mellem patogenicitet og α-amylase udtryk og aktivitet blev observeret 7,8. Hæmning af α-amylase aktivitet enten gennem gen knockout eller knockdown tilgange påvirker negativt svampe vækst og toksin produktion. En α-amylase knockout mutant af A. flavus var ude af stand til at producere aflatoksiner når dyrkes på stivelse substrat eller degermed majs kerner9. På samme måde i Fusarium verticillioides undladt en α-amylase knockout stamme at producere fumonisin B1 (mykotoksin) under infektion af majs kerner10. I en nyere undersøgelse viste Gilbert et al. (2018), at et RNAi-baserede banke ned af A. flavus α-amylase udtryk gennem HIGS betydeligt reduceret A. flavus vækst og aflatoksin produktion under majs kerne infektion11 .

Specifikke hæmmere af α-amylase aktivitet har også produceret lignende resultater som fremstillet af ned-regulering af α-amylase udtryk. Den første rapport om rollen af en α-amylase hæmmer i svampe modstand kom fra isolering og karakterisering af en 14-kDa trypsin-α-amylase hæmmer fra majs linjer resistente over for A. flavus12. Yderligere screening af flere hundreder af plantearter af Fakhoury og Woloshuk førte til identifikation af en 36-kDa α-amylase inhibitor-lignende protein (AILP) af frøene fra hyacinth bønner, hjelmbønne purpureus L.13. Peptid sekvensen af AILP lignede lektiner tilhører familien lektin-arcelin-α-amylase hæmmer rapporteret til fælles bean14,15. Renset AILP udviser ikke nogen hæmmende aktivitet mod pattedyr trypsin og yderligere in vitro-karakterisering viste betydelige hæmning af A. flavus vækst og conidial spiring13. Betænkninger her klart viser α-amylase kan tjene som et mål i kontrol tilgange til at begrænse patogener eller skadedyr, der afhænger af stivelse mobilisering (gennem α-amylase aktivitet) og erhvervelse af opløselige sukkerarter som energikilde under deres patogen interaktion med værtsplanter.

Alpha-amylase er kendt for at være kritiske i A. flavus patogenicitet9,10,11, og i betragtning af betydningen af AILP som en potent anti-A. flavus agent (α-amylase hæmning/antigrowth)13, Vi genereret transgene majs planter at udtrykke hjelmbønne AILP gen den konstituerende CaMV 35S promotor. Målet var at undersøge hvis heterolog ekspression af denne α-amylase hæmmer i majs er effektiv mod A. flavus patogenese og aflatoksin produktion under majs kerne infektion. Vores resultater viser, at transgene majs kerner udtrykker AILP betydeligt reduceret A. flavus vækst og aflatoksin produktion under kerne infektion.

Protocol

1. plasmid konstruktioner og majs transformation PCR forstærke hjelmbønne AILP indsætte ved hjælp af primere 5′-TATCTAGAACTAGTGATTACCATGGCTCC-3 ‘og 5′-ATACTGCAGGATTGCATGCAGAGTAGTACTG-3’. PCR omfatter en indledende denaturering skridt på 98 ° C til 30 s (trin 1), efterfulgt af denaturering på 98 ° C i 10 s (trin 2), udglødning ved 55 ° C i 30 s (trin 3), brudforlængelse ved 72 ° C i 20 s (trin 4), 31 cyklusser af trin 2 til trin 4 , og en afsluttende brudforlængelse trin ved 72 ° C i 5 min…

Representative Results

Majs transformation og molekylær screening af transgene planter Umodne embryoner af majs Hi-II linjer var transformeret med Agrobacterium tumefaciens EHA101 stamme der indeholder den endelige plante destination vektor udtrykker hjelmbønne purpureus AILP genet under kontrol af CaMV 35S promotor. Fem uafhængigt transformerede majs linjer var avanceret til T6 generation for ef…

Discussion

Udbyttetab i landbrugsafgrøder som følge af patogener og skadedyr er et globalt problem20. I øjeblikket, anvendelse af syntetiske fungicider og pesticider er den fremherskende metode for kontrollerende plante patogener og skadedyr, men resterende toksicitet af disse biokemikalier i fødevarer og foder kan medføre alvorlig trussel for menneskers og dyrs sundhed21. I betragtning af den økonomiske betydning af majs som fødevarer og foder afgrøder, reduktion eller elimin…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker David Meints, University of Arkansas for hans hjælp med at udvikle og analysere den transgene majs under de tidlige generationer. Dette arbejde modtaget økonomisk støtte fra USDA-ARS CRIS-projektet 6054-42000-025-00D. Omtale af handelsnavne eller kommercielle produkter i denne artikel er udelukkende til brug for specifikke oplysninger og indebærer ikke anbefaling eller godkendelse af den US Department of Agriculture. USDA-ARS’ lig beskæftigelse lejlighed (EEO) politiske mandater lige muligheder for alle personer og forbyder diskrimination i alle aspekter af agenturets personalepolitik, praksis og operationer.

Materials

Agar Caisson
Amazing Marine Goop Eclectic Products
C1000 Touch CFX96 Real-Time System Bio-Rad
Corning Falcon Tissue Culture Dishes, 60 mm Fisher Scientific 08-772F
Eppendorf 5424 Microcentrifuge Fisher Scientific
Erlenmeyer flask with stopper, 50 mL Ace Glass 6999-10
Ethanol
FluoroQuant Afla Romer Labs COKFA1010
Fluted Qualitative Filter Paper Circles, 15 cm Fisher Scientific 09-790-14E
Force Air Oven VWR
FQ-Reader Romer Labs EQFFM3010
Geno/Grinder 2010 OPS Diagnostics SP 2010-115
Innova 44 Incubator Shaker Brunswick Scientific
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708890
liquid Nitrogen
Low Form Griffin Beakers, 100 mL DKW Life Sciences 14000-100
Methanol
Methylene Chloride
Nexttec 1-step DNA Isolation Kit for Plants Nexttec 47N
Nikon Eclipse E600 microscope with Nikon DS-Qi1 camera Nikon
Nikon SMZ25 stereomicroscope with C-HGFI Episcopic Illuminator and Andor Zyla 4.2 sCMOS camera Nikon
Nunc Square BioAssay Dishes ThermoFisher Scientific 240835
Phire Plant Direct PCR Kit ThermoFisher Scientific F130WH
Polycarbonate Vials, 15 ml OPS Diagnostics PCRV 15-100-23
Potato Dextrose Broth
Snap Cap, 22 mm DKW Life Sciences 242612
Sodium Phosphate dibasic heptahydrate Sigma-Aldrich
Sodium Phosphate monobasic Sigma-Aldrich
Spectrum Plant Total RNA Kit Sigma-Aldrich STRN50
Stainless Steel Grinding Balls, 3/8'' OPS Diagnostics GBSS 375-1000-02
Stir Plate
Synergy 4 Fluorometer Biotek
T100 Thermal Cycler Bio-Rad
Triton X-100 Sigma-Aldrich T-9284
V8 juice Campbell's
Whatman Qualitative Grade Plain Sheets, Grade 3 Fisher Scientific 09-820P
Wrist-Action Shaker Burrell Scientific

References

  1. Ismaiel, A., Papenbrock, J. Mycotoxins: Producing fungi and mechanisms of phytotoxicity. Agriculture. 5 (3), 492-537 (2015).
  2. Mitchell, N., Bowers, E., Hurburgh, C., Wu, F. Potential economic losses to the USA corn industry from aflatoxin contamination. Food Additives & Contaminants: Part A. 33 (3), 540-550 (2016).
  3. Umesha, S., Manukumar, H. M., Chandrasekhar, B., Shivakumara, P., Shiva Kumar, J., Raghava, S., Avinash, P., Shirin, M., Bharathi, T. R., Rajini, S. B., Nandhini, M., Vinaya Rani, G., Shobha, M., Prakash, H. S. Aflatoxins and food pathogens: Impact of biologically active aflatoxins and their control strategies. Journal of the Science of Food and Agriculture. , (2016).
  4. Brown, R. L., Menkir, A., Chen, Z. Y., Bhatnagar, D., Yu, J., Yao, H., Cleveland, T. E. Breeding aflatoxin-resistant maize lines using recent advances in technologies – a review. Food Additives & Contaminants – Part A Chemistry, Analysis, Control, Exposure & Risk Assessment. 30 (8), 1382-1391 (2013).
  5. Abbas, H., Accinelli, C., Shier, W. T. Biological control of aflatoxin contamination in U.S. crops and the use of bioplastic formulations of Aspergillus flavus biocontrol strains to optimize application strategies. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65, 7081-7087 (2017).
  6. Udomkun, P., Wiredu, A. N., Nagle, M., Müller, J., Vanlauwe, B., Bandyopadhyay, R. Innovative technologies to manage aflatoxins in foods and feeds and the profitability of application – A review. Food Control. 76, 127-138 (2017).
  7. Dohroo, N. P., Bhardwaj, S. S., Shyram, K. R. Amylase and invertase activity as influenced by Pythium pleroticum causing rhizome rot of ginger. Plant Disease Research. 2, 106-107 (1987).
  8. Singh, R., Saxena, V. S., Singh, R. Pectinolytic, cellulolytic, amylase and protease production by three isolates of Fusarium solani variable in their virulence. Indian Journal of Mycology and Plant Pathology. 19, 22-29 (1989).
  9. Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. Amy1, the α-amylase gene of Aspergillus flavus: Involvement in aflatoxin biosynthesis in maize kernels. Phytopathology. 89 (10), 908-914 (1999).
  10. Bluhm, B. H., Woloshuk, C. P. Amylopectin induces Fumonisin B1 production by Fusarium verticillioides during colonization of maize kernels. Molecular Plant-Microbe Interactions. 18 (12), 1333-1339 (2005).
  11. Gilbert, M. K., Majumdar, R., Rajasekaran, K., Chen, Z. Y., Wei, Q., Sickler, C. M., Lebar, M. D., Cary, J. W., Frame, B. R., Wang, K. RNA interference-based silencing of the a-amylase (amy1) gene in Aspergillus flavus decreases fungal growth and aflatoxin production in maize kernels. Planta. 247 (6), 1465-1473 (2018).
  12. Chen, Z. Y., Brown, R. L., Russin, J. S., Lax, A. R., Cleveland, T. E. A corn trypsin inhibitor with antifungal activity inhibits Aspergillus flavus α-amylase. Phytopathology. 89 (18944733), 902-907 (1999).
  13. Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. Inhibition of growth of Aspergillus flavus and fungal α-amylases by a lectin-like protein from Lablab purpureus. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (8), 955-961 (2001).
  14. Mirkov, T. E., Wahlstrom, J. M., Hagiwara, K., Finardi-Filho, F., Kjemtrup, S., Chrispeels, M. J. Evolutionary relationships among proteins in the phytohemagglutinin-arcelin-a-amylase inhibitor family of the common bean and its relatives. Plant Molecular Biology. 26 (4), 1103-1113 (1994).
  15. Kim, Y. H., Woloshuk, C. P., Cho, E. H., Bae, J. M., Song, Y. S., Huh, G. H. Cloning and functional expression of the gene encoding an inhibitor against Aspergillus flavus a-amylase, a novel seed lectin from Lablab purpureus (Dolichos lablab). Plant Cell Reports. 26 (4), 395-405 (2007).
  16. Frame, B., Main, M., Schick, R., Wang, K., Thorpe, T. A., Yeung, E. C. Ch. 22. Plant Embryo Culture. 710, 327-341 (2011).
  17. Rajasekaran, K., Sickler, C. M., Brown, R. L., Cary, J. W., Bhatnagar, D. Evaluation of resistance to aflatoxin contamination in kernels of maize genotypes using a GFP-expressing Aspergillus flavus strain. World Mycotoxin Journal. 6 (2), 151-158 (2013).
  18. Rajasekaran, K., Sayler, R. J., Sickler, C. M., Majumdar, R., Jaynes, J. M., Cary, J. W. Control of Aspergillus flavus growth and aflatoxin production in transgenic maize kernels expressing a tachyplesin-derived synthetic peptide, AGM182. Plant Science. , 150-156 (2018).
  19. Shu, X., Livingston, D. P., Franks, R. G., Boston, R. S., Woloshuk, C. P., Payne, G. A. Tissue-specific gene expression in maize seeds during colonization by Aspergillus flavus and Fusarium verticillioides. Molecular Plant Pathology. 16 (4), 662-674 (2015).
  20. Savary, S., Ficke, A., Aubertot, J. -. N., Hollier, C. Crop losses due to diseases and their implications for global food production losses and food security. Food Security. 4, 519-537 (2012).
  21. Damalas, C. A., Eleftherohorinos, I. G. Pesticide exposure, safety issues, and risk assessment indicators. International Journal of Environmental Research and Public Health. 8 (5), 1402-1419 (2011).
  22. Kowalska, A., Walkiewicz, K., Kozieł, P., Muc-Wierzgoń, M. Aflatoxins: Characterisitcs and impact on human health. Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej (Online). 71, 315-327 (2017).
  23. Rajasekaran, K., Cary, J. W., Cotty, P. J., Cleveland, T. E. Development of a GFP-expressing Aspergillus flavus strain to study fungal invasion, colonization, and resistance in cottonseed. Mycopathologia. 165 (2), 89-97 (2008).
  24. Punt, P., Dingemanse, M. A., Kuyvenhoven, A., Soede, R. D., Pouwels, P. H., van den Hondel, C. A. Functional elements in the promoter region of the Aspergillus nidulans gpdA gene encoding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Gene. 93 (1), 101-109 (1990).
  25. Lee, L. W., Chiou, C. H., Klomparens, K. L., Cary, J. W., Linz, J. E. Subcellular localization of aflatoxin biosynthetic enzymes Nor-1, Ver-1, and OmtA in time-dependent fractionated colonies of Aspergillus parasiticus. Archives of Microbiology. 181 (3), 204-214 (2004).
  26. Bhatnagar, D., Cary, J. W., Ehrlich, K., Yu, J., Cleveland, T. E. Understanding the genetics of regulation of aflatoxin production and Aspergillus flavus development. Mycopathologia. 162, 155-166 (2006).
  27. Williams, W. P., Krakowsky, M. D., Scully, B. T., Brown, R. L., Menkir, A., Warburton, M. L., Windham, G. L. Identifying and developing maize germplasm with resistance to accumulation of aflatoxins. World Mycotoxin Journal. 8 (2), 193-209 (2015).
  28. Broekaert, W. F., van Parijs, J., Leyns, F., Joos, H., Peumans, W. J. A chitin-binding lectin from stinging nettle rhizomes with antifungal properties. Science. 245 (4922), 1100-1102 (1989).
  29. Vanparijs, J., Broekaert, W. F., Goldstein, I. J., Peumans, W. J. Hevein-an antifungal protein from rubber-tree (Hevea brasiliensis) latex. Planta. 183, 258-264 (1991).
  30. Gozia, O., Ciopraga, J., Bentia, T., Lungu, M., Zamfirescu, I., Tudor, R., Roseanu, A., Nitu, F. Antifungal properties of lectin and new chitinases from potato tubers. Comptes Rendus de l’Academie des Sciences – Series III. 316 (8), 788-792 (1993).
  31. Wisessing, A., Choowongkomon, K. Amylase inhibitors in plants: Structures, Functions and Applications. Functional Plant Science and Biotechnology. 6 (1), 31-41 (2012).
  32. Tyagi, B., Trivedi, N., Dubey, A. a-amylase inhibitor: A compelling plant defense mechanism against insect/pests. Environment & Ecology. 32 (3), 995-999 (2014).
  33. Powers, J. R., Culbertson, J. D. In vitro effect of bean amylase inhibitor on insect amylases. Journal of Food Protection. 45, 655-657 (1982).
  34. Gatehouse, A. M. R., Fenton, K. A., Jepson, I., Pavey, D. J. The effects of a-amylase inhibitors on insect storage pests: Inhibition of a-amylase in vitro and effects on development in vivo. Journal of the Science of Food and Agriculture. 37, 727-734 (1986).
  35. Blanco-Labra, A., Chagolla-Lopez, A., Martinez-Gallardo, N., Valdes-Rodriguez, S. Further characterization of the 12-kDa protease a-amylase inhibitor present in maize seeds. Journal of Food Biochemistry. 19, 27-41 (1995).
  36. Abdollahi, A., Buchanan, R. L. Regulation of aflatoxin biosynthesis: Induction of aflatoxin production by various carbohydrates. Journal of Food Science. 46, 633-635 (1981).
  37. Liu, J., Sun, L., Zhang, N., Zhang, J., Guo, J., Li, C., Rajput, S. A., Qi, D. Effects of nutrients in substrates of different grains on aflatoxin B1 production by Aspergillus flavus. BioMed Research International. 2016, (2016).
  38. Uppala, S. S., Bowen, K. L., Woods, F. M. Pre-harvest aflatoxin contamination and soluble sugars of peanut. Peanut Science. 40 (1), 40-51 (2013).
check_url/59169?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Rajasekaran, K., Sayler, R. J., Majumdar, R., Sickler, C. M., Cary, J. W. Inhibition of Aspergillus flavus Growth and Aflatoxin Production in Transgenic Maize Expressing the α-amylase Inhibitor from Lablab purpureus L.. J. Vis. Exp. (144), e59169, doi:10.3791/59169 (2019).

View Video