JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Environment

Ингибирование роста Aspergillus flavus и афлатоксина производства трансгенных кукурузы выражая α-амилаза ингибиторов от Lablab пурпурный л

Published: February 15, 2019
doi:
10.3791/59169
, , , ,
1Southern Regional Research Center,USDA-ARS, Food and Feed Safety Research Unit, 2Department of Plant Pathology,University of Arkansas

Summary

Здесь мы представляем протокол для анализа роста Aspergillus flavus и производство афлатоксина в кукурузы ядра, выражая противогрибковые белка.  Мониторинг с помощью GFP-выражая A. flavus штамм мы инфекции и распространению гриба в зрелых ядра в режиме реального времени. Assay, быстрых, надежных и воспроизводимых.

Abstract

Серьезной проблемой во всем мире является загрязнение афлатоксина в пищевых и кормовых культур. Афлатоксины, производимые гриба Aspergillus flavus (A. flavus) являются мощными канцерогенами, которые существенно снижают стоимость урожая кукурузы и богатых культур других нефти как арахисовое помимо представляет серьезную угрозу для здоровья человека и животных. Различные подходы, включая традиционной селекции, трансгенных выражение сопротивления связанных белков и РНК-интерференции (RNAi)-на основе подавления экспрессии гена хост индуцированной из критических A. flavus гена целевых объектов, оцениваются для увеличения афлатоксин сопротивление в восприимчивых культур. Последние исследования показали, что важная роль α-амилазы в производстве A. flavus патогенеза и афлатоксин, предлагая этот ген/фермент является потенциальной мишенью для снижения роста A. flavus и производства афлатоксина. В этой связи текущее исследование было проведено для оценки гетерологичных выражение Lablab пурпурный л α-амилазы ингибиторы как белка (AILP) в кукурузы против A. flavus(под контролем учредительного промотора 35S CaMV). AILP — 36 kDa белок, который конкурентный ингибитор фермента α-амилазы A. flavus и принадлежит к семейству белков Лектин arcelin-α-амилазы ингибиторы в общем бин. Исследования in vitro до текущей работы продемонстрировал роль AILP в ингибирование активности α-амилазы A. flavus и роста плесени. Микоз и производство афлатоксина в зрелых ядра были мониторинг в режиме реального времени с помощью GFP-выражая A. flavus штамм. Это ядро отбора пробы (КСА) очень проста в настройке и предоставляет данные надежных и воспроизводимых на инфекции и масштабов распространения, которые могут быть количественно для оценки зародышевой плазмы и трансгенных линий. Флуоресценции от штамма GFP тесно взаимосвязанных чтобы грибковые роста и, путем расширения, это хорошо коррелированных афлатоксина ценностям.  Цель работы текущего было осуществлять предыдущие знания в коммерчески важных культур, как кукуруза для увеличения сопротивления афлатоксина. Наши результаты показывают снижение 35-72% A. flavus роста в AILP-выражая трансгенных кукурузы ядра, которые, в свою очередь, переведены на 62% – 88% снижение уровня афлатоксина.

Introduction

Контаминации, грибковых родов Aspergillus, фузариозу, Penicilliumи Alternaria является одной из основных проблем продовольствия и кормов культур во всем мире1,2,3. Среди этих Фитопатогенные грибов Aspergillus имеет наивысший негативное воздействие на стоимость урожая и здоровье человека и животных. Aspergillus flavus (A. flavus) это оппортунистическая завод возбудителя, который заражает нефти богатых культур, таких как кукуруза, хлопковое и арахиса и производит мощный канцерогенов, афлатоксинов, а также многочисленные токсичных вторичных метаболитов (SMs). Кукуруза является важной пищей и кормить культур выращивается во всем мире и очень чувствительны к загрязнению A. flavus. Экономические последствия загрязнения афлатоксином теряет и снижение стоимости в кукурузы может быть как $686.6 млн в год в США2 с прогнозируемые изменения глобального климата, воздействие афлатоксинов может привести к большей экономических потерь кукурузы с оценки как высокого как $1,68 млрд в год в ближайшем будущем2. С учетом экономических и медицинских последствий афлатоксинов в организме человека и животных, управления афлатоксина до сбора урожая кукурузы может быть наиболее эффективным способом предотвратить загрязнение афлатоксина в пищевых продуктах и кормить продуктов.

Основные управления до сбора урожая подход для сопротивления афлатоксина в кукурузы, которая широко используется в последние несколько десятилетий является главным образом путем селекции, которая требует значительного количества времени4. Недавно биоконтроль добился определенных успехов в сокращении афлатоксина в больших масштабах поля приложения5,6. Помимо биоконтроль применение передовых молекулярных инструменты, такие как «Хост индуцированной сайленсинга генов» (HIGS) через RNAi и трансгенных выражение сопротивления связанных белков добился определенных успехов в сокращении роста A. flavus и афлатоксина производство в небольших масштабах лабораторных и полевых исследований. Эти подходы являются в настоящее время осуществляется оптимизация Помимо выявления новых потенциальных A. flavus гена цели для будущих манипуляции.

Помимо генов, которые непосредственно участвуют в микотоксинов в качестве потенциальных целей стратегий трансгенных контроля было показано грибковых амилаз играть решающую роль в обеспечении успешного производства патогенеза и образование микотоксинов во время ранних стадиях хост завод инфекции. Несколько примеров Pythium pleroticum (возбудителя имбиря корневища гнилью), фузариозу Солани (возбудителя увяданию цветная капуста), где положительные корреляции между патогенности и α-амилазы выражение и деятельности были замечены 7,8. Ингибирование активности α-амилазы через Нокаут гена или нокдаун подходы отрицательно сказывается на грибковые роста и токсинного производства. Α-амилазы нокаут мутантов A. flavus был не в состоянии производить афлатоксинов при выращивании на крахмал субстрата или degermed кукурузы ядра9. Аналогичным образом в Fusarium verticillioides штамма нокаут α-амилазы не производить Фумонизин B1 (микотоксинов) во время инфекции кукурузы ядра10. В более недавнем исследовании Гилберт et al. (2018) показали, что на основе RNAi сбить A. flavus α-амилазы выражения через HIGS значительно сократить производство роста и афлатоксина A. flavus во время кукурузы ядра инфекции11 .

Специфичные ингибиторы активности α-амилазы также дали аналогичные результаты, полученные от вниз регуляцию экспрессии α-амилазы. Первый доклад по вопросу о роли ингибитор α-амилазы в грибковых сопротивления пришли из изоляции и характеристика ингибитор трипсина α-амилазы 14-кДа из кукурузы линии устойчивы к A. flavus12. Дальнейшего скрининга нескольких сотен видов растений Фахури и Woloshuk привели к выявлению 36 kDa белок α-амилазы ингибиторы как (AILP) из семян бобов гиацинт, пурпурный Lablab L.13. Пептид последовательность AILP напоминала лектинов, принадлежащих к семейству Лектин arcelin-α-амилазы ингибиторы сообщили в общем бин14,15. Очищенный AILP не проявляют любой ингибиторная активность на млекопитающих трипсина и далее в пробирке характеристика показали значительное торможение роста A. flavus и конидиальная всхожесть13. Доклады, представленные здесь ясно показывает α-амилазы может служить цели управления подходов к ограничению возбудителей болезней или вредителей, которые зависят от мобилизации крахмала (через активности α-амилазы) и приобретения растворимых сахаров в качестве источника энергии во время их патогенные взаимодействие с растений-хозяев.

Альфа амилаза, как известно, быть критическим в A. flavus патогенности9,10,11и с учетом важности AILP как мощным анти-A. flavus агент (α-амилазы ингибирование/опровергнут)13, Мы создали трансгенных растений кукурузы, выражая Lablab AILP гена под учредительного CaMV 35S промоутер. Целью было расследовать если гетерологичных выражение этой α-амилазы ингибиторы в кукурузу эффективна против A. flavus патогенеза и афлатоксина производства во время кукурузы ядра инфекции. Наши результаты показывают, что трансгенных кукурузы ядра, выражая AILP значительно сократить производство роста и афлатоксина A. flavus во время ядра инфекции.

Protocol

1. плазмидные конструкции и кукурузы преобразования PCR усиливает Lablab AILP вставить с помощью грунтовки, 5′-TATCTAGAACTAGTGATTACCATGGCTCC-3 “и 5′-ATACTGCAGGATTGCATGCAGAGTAGTACTG-3». Условия PCR включают первоначальный денатурации шаг на 98 ° C за 30 s (шаг 1), а затем денатурации на 98 ° C 10 s (шаг 2), отжиг при температуре 55 ?…

Representative Results

Кукурузы трансформации и молекулярных скрининг трансгенных растений Незрелых зародышей кукурузы Hi-II линий были преобразованы с помощью Agrobacterium tumefaciens EHA101 штамма, содержащий последний завод назначения вектора выражения …

Discussion

Потери урожая сельскохозяйственных культур вследствие патогенов и вредителей является глобальной проблемой20. В настоящее время применение синтетических фунгицидов и пестицидов является преобладающим средством для контроля патогенов растений и вредителей, но остаточн?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Дэвида Майнтс, Университет штата Арканзас за его помощь в разработке и анализе трансгенных кукурузы во время ранних поколений. Эта работа получила финансовую поддержку проекта USDA-ARS Сири 6054-42000-025-00D. Торговые наименования или коммерческих продуктов в этой статье упоминаются исключительно с целью предоставления конкретной информации и не подразумевает рекомендации или одобрения Министерством сельского хозяйства. Политики равных возможностей занятости (РВЗ) USDA-ARS мандатов равных возможностей для всех лиц и запрещает дискриминацию во всех аспектах кадровой политики, практики и операций Агентства.

Materials

Agar Caisson
Amazing Marine Goop Eclectic Products
C1000 Touch CFX96 Real-Time System Bio-Rad
Corning Falcon Tissue Culture Dishes, 60 mm Fisher Scientific 08-772F
Eppendorf 5424 Microcentrifuge Fisher Scientific
Erlenmeyer flask with stopper, 50 mL Ace Glass 6999-10
Ethanol
FluoroQuant Afla Romer Labs COKFA1010
Fluted Qualitative Filter Paper Circles, 15 cm Fisher Scientific 09-790-14E
Force Air Oven VWR
FQ-Reader Romer Labs EQFFM3010
Geno/Grinder 2010 OPS Diagnostics SP 2010-115
Innova 44 Incubator Shaker Brunswick Scientific
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708890
liquid Nitrogen
Low Form Griffin Beakers, 100 mL DKW Life Sciences 14000-100
Methanol
Methylene Chloride
Nexttec 1-step DNA Isolation Kit for Plants Nexttec 47N
Nikon Eclipse E600 microscope with Nikon DS-Qi1 camera Nikon
Nikon SMZ25 stereomicroscope with C-HGFI Episcopic Illuminator and Andor Zyla 4.2 sCMOS camera Nikon
Nunc Square BioAssay Dishes ThermoFisher Scientific 240835
Phire Plant Direct PCR Kit ThermoFisher Scientific F130WH
Polycarbonate Vials, 15 ml OPS Diagnostics PCRV 15-100-23
Potato Dextrose Broth
Snap Cap, 22 mm DKW Life Sciences 242612
Sodium Phosphate dibasic heptahydrate Sigma-Aldrich
Sodium Phosphate monobasic Sigma-Aldrich
Spectrum Plant Total RNA Kit Sigma-Aldrich STRN50
Stainless Steel Grinding Balls, 3/8'' OPS Diagnostics GBSS 375-1000-02
Stir Plate
Synergy 4 Fluorometer Biotek
T100 Thermal Cycler Bio-Rad
Triton X-100 Sigma-Aldrich T-9284
V8 juice Campbell's
Whatman Qualitative Grade Plain Sheets, Grade 3 Fisher Scientific 09-820P
Wrist-Action Shaker Burrell Scientific
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ismaiel, A., Papenbrock, J. Mycotoxins: Producing fungi and mechanisms of phytotoxicity. Agriculture. 5 (3), 492-537 (2015).
  2. Mitchell, N., Bowers, E., Hurburgh, C., Wu, F. Potential economic losses to the USA corn industry from aflatoxin contamination. Food Additives & Contaminants: Part A. 33 (3), 540-550 (2016).
  3. Umesha, S., Manukumar, H. M., Chandrasekhar, B., Shivakumara, P., Shiva Kumar, J., Raghava, S., Avinash, P., Shirin, M., Bharathi, T. R., Rajini, S. B., Nandhini, M., Vinaya Rani, G., Shobha, M., Prakash, H. S. Aflatoxins and food pathogens: Impact of biologically active aflatoxins and their control strategies. Journal of the Science of Food and Agriculture. , (2016).
  4. Brown, R. L., Menkir, A., Chen, Z. Y., Bhatnagar, D., Yu, J., Yao, H., Cleveland, T. E. Breeding aflatoxin-resistant maize lines using recent advances in technologies – a review. Food Additives & Contaminants – Part A Chemistry, Analysis, Control, Exposure & Risk Assessment. 30 (8), 1382-1391 (2013).
  5. Abbas, H., Accinelli, C., Shier, W. T. Biological control of aflatoxin contamination in U.S. crops and the use of bioplastic formulations of Aspergillus flavus biocontrol strains to optimize application strategies. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65, 7081-7087 (2017).
  6. Udomkun, P., Wiredu, A. N., Nagle, M., Müller, J., Vanlauwe, B., Bandyopadhyay, R. Innovative technologies to manage aflatoxins in foods and feeds and the profitability of application – A review. Food Control. 76, 127-138 (2017).
  7. Dohroo, N. P., Bhardwaj, S. S., Shyram, K. R. Amylase and invertase activity as influenced by Pythium pleroticum causing rhizome rot of ginger. Plant Disease Research. 2, 106-107 (1987).
  8. Singh, R., Saxena, V. S., Singh, R. Pectinolytic, cellulolytic, amylase and protease production by three isolates of Fusarium solani variable in their virulence. Indian Journal of Mycology and Plant Pathology. 19, 22-29 (1989).
  9. Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. Amy1, the α-amylase gene of Aspergillus flavus: Involvement in aflatoxin biosynthesis in maize kernels. Phytopathology. 89 (10), 908-914 (1999).
  10. Bluhm, B. H., Woloshuk, C. P. Amylopectin induces Fumonisin B1 production by Fusarium verticillioides during colonization of maize kernels. Molecular Plant-Microbe Interactions. 18 (12), 1333-1339 (2005).
  11. Gilbert, M. K., Majumdar, R., Rajasekaran, K., Chen, Z. Y., Wei, Q., Sickler, C. M., Lebar, M. D., Cary, J. W., Frame, B. R., Wang, K. RNA interference-based silencing of the a-amylase (amy1) gene in Aspergillus flavus decreases fungal growth and aflatoxin production in maize kernels. Planta. 247 (6), 1465-1473 (2018).
  12. Chen, Z. Y., Brown, R. L., Russin, J. S., Lax, A. R., Cleveland, T. E. A corn trypsin inhibitor with antifungal activity inhibits Aspergillus flavus α-amylase. Phytopathology. 89 (18944733), 902-907 (1999).
  13. Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. Inhibition of growth of Aspergillus flavus and fungal α-amylases by a lectin-like protein from Lablab purpureus. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (8), 955-961 (2001).
  14. Mirkov, T. E., Wahlstrom, J. M., Hagiwara, K., Finardi-Filho, F., Kjemtrup, S., Chrispeels, M. J. Evolutionary relationships among proteins in the phytohemagglutinin-arcelin-a-amylase inhibitor family of the common bean and its relatives. Plant Molecular Biology. 26 (4), 1103-1113 (1994).
  15. Kim, Y. H., Woloshuk, C. P., Cho, E. H., Bae, J. M., Song, Y. S., Huh, G. H. Cloning and functional expression of the gene encoding an inhibitor against Aspergillus flavus a-amylase, a novel seed lectin from Lablab purpureus (Dolichos lablab). Plant Cell Reports. 26 (4), 395-405 (2007).
  16. Frame, B., Main, M., Schick, R., Wang, K., Thorpe, T. A., Yeung, E. C. Ch. 22. Plant Embryo Culture. 710, 327-341 (2011).
  17. Rajasekaran, K., Sickler, C. M., Brown, R. L., Cary, J. W., Bhatnagar, D. Evaluation of resistance to aflatoxin contamination in kernels of maize genotypes using a GFP-expressing Aspergillus flavus strain. World Mycotoxin Journal. 6 (2), 151-158 (2013).
  18. Rajasekaran, K., Sayler, R. J., Sickler, C. M., Majumdar, R., Jaynes, J. M., Cary, J. W. Control of Aspergillus flavus growth and aflatoxin production in transgenic maize kernels expressing a tachyplesin-derived synthetic peptide, AGM182. Plant Science. , 150-156 (2018).
  19. Shu, X., Livingston, D. P., Franks, R. G., Boston, R. S., Woloshuk, C. P., Payne, G. A. Tissue-specific gene expression in maize seeds during colonization by Aspergillus flavus and Fusarium verticillioides. Molecular Plant Pathology. 16 (4), 662-674 (2015).
  20. Savary, S., Ficke, A., Aubertot, J. -. N., Hollier, C. Crop losses due to diseases and their implications for global food production losses and food security. Food Security. 4, 519-537 (2012).
  21. Damalas, C. A., Eleftherohorinos, I. G. Pesticide exposure, safety issues, and risk assessment indicators. International Journal of Environmental Research and Public Health. 8 (5), 1402-1419 (2011).
  22. Kowalska, A., Walkiewicz, K., Kozieł, P., Muc-Wierzgoń, M. Aflatoxins: Characterisitcs and impact on human health. Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej (Online). 71, 315-327 (2017).
  23. Rajasekaran, K., Cary, J. W., Cotty, P. J., Cleveland, T. E. Development of a GFP-expressing Aspergillus flavus strain to study fungal invasion, colonization, and resistance in cottonseed. Mycopathologia. 165 (2), 89-97 (2008).
  24. Punt, P., Dingemanse, M. A., Kuyvenhoven, A., Soede, R. D., Pouwels, P. H., van den Hondel, C. A. Functional elements in the promoter region of the Aspergillus nidulans gpdA gene encoding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Gene. 93 (1), 101-109 (1990).
  25. Lee, L. W., Chiou, C. H., Klomparens, K. L., Cary, J. W., Linz, J. E. Subcellular localization of aflatoxin biosynthetic enzymes Nor-1, Ver-1, and OmtA in time-dependent fractionated colonies of Aspergillus parasiticus. Archives of Microbiology. 181 (3), 204-214 (2004).
  26. Bhatnagar, D., Cary, J. W., Ehrlich, K., Yu, J., Cleveland, T. E. Understanding the genetics of regulation of aflatoxin production and Aspergillus flavus development. Mycopathologia. 162, 155-166 (2006).
  27. Williams, W. P., Krakowsky, M. D., Scully, B. T., Brown, R. L., Menkir, A., Warburton, M. L., Windham, G. L. Identifying and developing maize germplasm with resistance to accumulation of aflatoxins. World Mycotoxin Journal. 8 (2), 193-209 (2015).
  28. Broekaert, W. F., van Parijs, J., Leyns, F., Joos, H., Peumans, W. J. A chitin-binding lectin from stinging nettle rhizomes with antifungal properties. Science. 245 (4922), 1100-1102 (1989).
  29. Vanparijs, J., Broekaert, W. F., Goldstein, I. J., Peumans, W. J. Hevein-an antifungal protein from rubber-tree (Hevea brasiliensis) latex. Planta. 183, 258-264 (1991).
  30. Gozia, O., Ciopraga, J., Bentia, T., Lungu, M., Zamfirescu, I., Tudor, R., Roseanu, A., Nitu, F. Antifungal properties of lectin and new chitinases from potato tubers. Comptes Rendus de l’Academie des Sciences – Series III. 316 (8), 788-792 (1993).
  31. Wisessing, A., Choowongkomon, K. Amylase inhibitors in plants: Structures, Functions and Applications. Functional Plant Science and Biotechnology. 6 (1), 31-41 (2012).
  32. Tyagi, B., Trivedi, N., Dubey, A. a-amylase inhibitor: A compelling plant defense mechanism against insect/pests. Environment & Ecology. 32 (3), 995-999 (2014).
  33. Powers, J. R., Culbertson, J. D. In vitro effect of bean amylase inhibitor on insect amylases. Journal of Food Protection. 45, 655-657 (1982).
  34. Gatehouse, A. M. R., Fenton, K. A., Jepson, I., Pavey, D. J. The effects of a-amylase inhibitors on insect storage pests: Inhibition of a-amylase in vitro and effects on development in vivo. Journal of the Science of Food and Agriculture. 37, 727-734 (1986).
  35. Blanco-Labra, A., Chagolla-Lopez, A., Martinez-Gallardo, N., Valdes-Rodriguez, S. Further characterization of the 12-kDa protease a-amylase inhibitor present in maize seeds. Journal of Food Biochemistry. 19, 27-41 (1995).
  36. Abdollahi, A., Buchanan, R. L. Regulation of aflatoxin biosynthesis: Induction of aflatoxin production by various carbohydrates. Journal of Food Science. 46, 633-635 (1981).
  37. Liu, J., Sun, L., Zhang, N., Zhang, J., Guo, J., Li, C., Rajput, S. A., Qi, D. Effects of nutrients in substrates of different grains on aflatoxin B1 production by Aspergillus flavus. BioMed Research International. 2016, (2016).
  38. Uppala, S. S., Bowen, K. L., Woods, F. M. Pre-harvest aflatoxin contamination and soluble sugars of peanut. Peanut Science. 40 (1), 40-51 (2013).

Tags

Aspergillus FlavusAflatoxinMaizeTransgenicα-amylase InhibitorLablab PurpureusKernel Screening AssayGreen Fluorescent ProteinFungal InfectionAntifungal Properties
check_url/59169?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Rajasekaran, K., Sayler, R. J., Majumdar, R., Sickler, C. M., Cary, J. W. Inhibition of Aspergillus flavus Growth and Aflatoxin Production in Transgenic Maize Expressing the α-amylase Inhibitor from Lablab purpureus L.. J. Vis. Exp. (144), e59169, doi:10.3791/59169 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image