Remming van de groei van de Aspergillus flavus en aflatoxine productie in transgene maïs uiten van de α-amylase Inhibitor van Lablab purpureus L.
Summary
Hier presenteren we een protocol om Aspergillus flavus groei en productie van aflatoxine in maïs kernels uiting van een antischimmel eiwit te analyseren. Met behulp van een stam GFP-uiten A. flavus bewaakt we de infectie en de verspreiding van de schimmel in volwassen kernels in real-time. De bepaling is snel, betrouwbaar en reproduceerbaar.
Abstract
Van verontreiniging met aflatoxinen in levensmiddelen en diervoeders gewassen is een grote uitdaging wereldwijd. Aflatoxinen, geproduceerd door de schimmel Aspergillus flavus (A. flavus) zijn krachtige carcinogenen zijn die aanzienlijke vermindering van de waarde van het gewas in maïs en andere gewassen olie rijk zoals pinda naast ernstige bedreiging voor de gezondheid van mens en dier. Verschillende benaderingen, met inbegrip van traditionele fokken, transgene uiting van weerstand geassocieerde eiwitten en RNA-interferentie (RNAi)-gebaseerde host-geïnduceerde gene monddood maken van kritische A. flavus gene doelstellingen, worden geëvalueerd om te vergroten aflatoxine resistentie bij gevoelige gewassen. Afgelopen studies hebben aangetoond dat een belangrijke rol van α-amylase in A. flavus pathogenese en aflatoxine productie, suggereert dit gen/enzym is een potentieel doelwit zowel A. flavus groei en aflatoxine productie te verminderen. In dit opzicht werd de huidige studie uitgevoerd om te evalueren van heterologe expressie (onder controle van de constitutieve CaMV 35S promotor) van een Lablab purpureus L. α-amylase Inhibitor van de omwenteling-achtige eiwitten (AILP) in maïs tegen A. flavus. AILP is een 36-kDa proteïne, die een concurrerende Inhibitor van A. flavus α-amylase enzym en behoort tot de familie van de eiwitten lectine – arcelin – α-amylase-remmer gemeen Boon. In vitro onderzoek voorafgaand aan de lopende werkzaamheden had aangetoond de rol van AILP in remming van A. flavus α-amylase activiteit en de groei van zwammen. De groei van zwammen en aflatoxine productie in volwassen kernels werden gevolgd in real time via een uiting van het GFP A. flavus stam. Deze kernel screening test (KSA) is zeer eenvoudig op te zetten en biedt betrouwbare en reproduceerbare gegevens over infectie en de mate van verspreiding, die kan worden gekwantificeerd voor evaluatie van kiemplasma en transgene lijnen. De fluorescentie van het GFP-stam is nauw gecorreleerde aan schimmel groei en in het verlengde daarvan, het is goed gecorreleerd aan aflatoxine waarden. Het doel van het huidige werk was om deze voorkennis in een commercieel belangrijk gewas als maïs om aflatoxine weerstand te verhogen. Onze resultaten tonen een korting van 35% – 72% in A. flavus groei in AILP-uiten transgene maïs kernels die, beurtelings, vertaald in 62%-88% vermindering aflatoxine.
Introduction
Mycotoxine besmetting door de schimmel geslachten, Aspergillus, Fusariumen Penicillium, Alternaria is een groot probleem van voedsel en diervoeders geteelde gewassen wereldwijd1,2,3. Onder deze plantpathogene schimmels heeft Aspergillus het hoogste nadelige effect op de waarde van het gewas en de gezondheid van mens en dier. Aspergillus flavus (A. flavus) is een opportunistische plant pathogenen die olie rijk gewassen zoals maïs-, katoenzaad- en pinda infecteert en produceert de potente kankerverwekkende stoffen, aflatoxinen, evenals talrijke giftige secundaire metabolieten (SMs). Maïs is een belangrijk voedsel en diervoeders gewas geteeld wereldwijd en is zeer gevoelig voor besmetting door A. flavus. De economische impact van de aflatoxineverontreiniging op verliest en lagere waarde in maïs kunnen maar liefst $686.6 miljoen per jaar in de VS2 met voorspelde veranderingen in het wereldklimaat, de impact van aflatoxinen kan leiden tot grotere economische verliezen in maïs met schatting zo hoog als $1,68 miljard per jaar in de nabije toekomst2. Gezien de negatieve effecten van de economische en de gezondheid van aflatoxinen in mens en vee, misschien controle van de wachttermijnen tot de oogst aflatoxine in maïs wel de meest efficiënte manier ter voorkoming van verontreiniging met aflatoxinen in levensmiddelen en diervoeders.
De aanpak van de grote wachttermijnen tot de oogst controle voor aflatoxine resistentie in maïs die uitgebreid in de afgelopen decennia is gebruikt is voornamelijk door het kweken, waarvoor een aanzienlijke hoeveelheid tijd4. Biocontrol had onlangs, heeft enig succes in vermindering van aflatoxine in grote schaal veld toepassingen5,6. Naast biocontrol heeft toepassing van geavanceerde moleculaire tools zoals ‘Host geïnduceerde Gene Silencing’ (HIGS) door middel van RNAi en transgene expressie van weerstand-geassocieerde eiwitten enig succes in vermindering van A. flavus groei en aflatoxine productie in kleine schaal laboratorium en veld studies. Deze benaderingen zijn momenteel naast het identificeren van nieuwe A. flavus gene doelwit voor toekomstige manipulatie wordt geoptimaliseerd.
Naast genen die rechtstreeks bij mycotoxine productie als doelwit van transgene bestrijdingsstrategieën betrokken zijn, is schimmel amylasen aangetoond dat ze spelen een cruciale rol bij het handhaven van succesvolle pathogenese en mycotoxine productie tijdens de vroege stadia van host plant infectie. Een paar voorbeelden zijn Pythium pleroticum (causale agent van gember rizoom rot), Fusarium solani (causale agent van bloemkool verwelken), waar positieve correlaties tussen pathogeniteit en α-amylase expressie en activiteit werden waargenomen 7,8. Remming van de activiteit van de α-amylase gen knock-out of vechtpartij benaderingen beïnvloedt negatief schimmel groei en toxine productie. Een α-amylase knockout mutant van A. flavus kon produceren van aflatoxinen als volwassen op zetmeel substraat of degermed maïs kernels9. Evenzo, Fusarium verticillioides een α-amylase knockout stam niet produceren fumonisine B1 (mycotoxine) tijdens de infectie van maïs kernels10. In een meer recente studie, Gilbert et al. (2018) aangetoond dat een RNAi gebaseerde knock down van A. flavus α-amylase meningsuiting via HIGS aanzienlijk verminderd A. flavus groei en aflatoxine productie tijdens maïs kernel infectie11 .
Specifieke remmers van α-amylase activiteit hebben ook soortgelijke resultaten opgeleverd, zoals down-regulatie van α-amylase expressie verkregen. Het eerste verslag over de rol van een α-amylase-remmer in schimmel weerstand kwam uit de isolatie en de karakterisering van een 14-kDa trypsine-α-amylase-remmer van maïs resistent tegen A. flavus12lijnen. Verder screening van honderden plantensoorten door Fakhoury en Woloshuk leidde tot de identificatie van een 36-kDa α-amylase Inhibitor van de omwenteling-achtige eiwitten (AILP) uit de zaden van de hyacint bonen, Lablab purpureus L.13. De volgorde van de peptide van de AILP leek op lectines behorend tot de familie van de lectine-arcelin-α-amylase-remmer gemeld gemeen bean14,15. Gezuiverde AILP doet niet elke inhiberende activiteit naar zoogdieren trypsine en verder in vitro karakterisering toonde significante remming van de groei van A. flavus en conidial kiemkracht13vertonen. De verslagen hier duidelijk toont α-amylase kan dienen als een doel in controle benaderingen te beperken van pathogenen of plagen die afhankelijk zijn van zetmeel mobilisatie (via α-amylase activiteit) en verwerving van oplosbare suikers als energiebron tijdens hun pathogene interactie met waardplanten.
Alpha-amylase is bekend om zijn kritische in A. flavus pathogeniteit9,10,11, en gezien het belang van AILP als een krachtige anti-A. flavus agent (α-amylase remming/antigrowth)13, We genereerden transgene maïs planten uitdrukken Lablab AILP gen onder de constitutieve CaMV 35S promotor. Het doel was om te onderzoeken als heterologe expressie van deze α-amylase-remmer in maïs effectief tegen A. flavus pathogenese en aflatoxine productie tijdens maïs kernel infectie is. Onze resultaten tonen aan dat transgene maïs kernels uiting van AILP aanzienlijk verminderd A. flavus groei en aflatoxine productie tijdens kernel infectie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Opbrengst verliezen in landbouwgewassen als gevolg van ziekteverwekkers en plagen is een mondiaal probleem20. Momenteel, toepassing van synthetische fungiciden en pesticiden is de overheersende middelen voor controle plant ziekteverwekkers en plagen, maar resterende toxiciteit van deze biochemische stoffen in levensmiddelen en diervoeders kan vormen ernstige bedreiging voor de gezondheid van mens en dier21. Gezien het economisch belang van maïs als voedsel en diervoeders g…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken David Meints, Universiteit van Arkansas voor zijn hulp bij de ontwikkeling en het analyseren van de transgene maïs tijdens de vroege generaties. Dit werk kreeg financiële steun van de USDA-ARS CRIS project 6054-42000-025-00D. Vermelding van handelsnamen of commerciële producten in dit artikel is uitsluitend met het oog op het verstrekken van specifieke informatie en houdt geen aanbeveling of bekrachtiging door het Amerikaanse ministerie van landbouw. USDA-ARS gelijke kansen van de werkgelegenheid (eet) beleid mandaten van gelijke kansen voor alle personen en verbiedt discriminatie op alle aspecten van het personeelsbeleid van het Agentschap, praktijken en bewerkingen.
Materials
| Agar | Caisson | ||
| Amazing Marine Goop | Eclectic Products | ||
| C1000 Touch CFX96 Real-Time System | Bio-Rad | ||
| Corning Falcon Tissue Culture Dishes, 60 mm | Fisher Scientific | 08-772F | |
| Eppendorf 5424 Microcentrifuge | Fisher Scientific | ||
| Erlenmeyer flask with stopper, 50 mL | Ace Glass | 6999-10 | |
| Ethanol | |||
| FluoroQuant Afla | Romer Labs | COKFA1010 | |
| Fluted Qualitative Filter Paper Circles, 15 cm | Fisher Scientific | 09-790-14E | |
| Force Air Oven | VWR | ||
| FQ-Reader | Romer Labs | EQFFM3010 | |
| Geno/Grinder 2010 | OPS Diagnostics | SP 2010-115 | |
| Innova 44 Incubator Shaker | Brunswick Scientific | ||
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | |
| liquid Nitrogen | |||
| Low Form Griffin Beakers, 100 mL | DKW Life Sciences | 14000-100 | |
| Methanol | |||
| Methylene Chloride | |||
| Nexttec 1-step DNA Isolation Kit for Plants | Nexttec | 47N | |
| Nikon Eclipse E600 microscope with Nikon DS-Qi1 camera | Nikon | ||
| Nikon SMZ25 stereomicroscope with C-HGFI Episcopic Illuminator and Andor Zyla 4.2 sCMOS camera | Nikon | ||
| Nunc Square BioAssay Dishes | ThermoFisher Scientific | 240835 | |
| Phire Plant Direct PCR Kit | ThermoFisher Scientific | F130WH | |
| Polycarbonate Vials, 15 ml | OPS Diagnostics | PCRV 15-100-23 | |
| Potato Dextrose Broth | |||
| Snap Cap, 22 mm | DKW Life Sciences | 242612 | |
| Sodium Phosphate dibasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium Phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | ||
| Spectrum Plant Total RNA Kit | Sigma-Aldrich | STRN50 | |
| Stainless Steel Grinding Balls, 3/8'' | OPS Diagnostics | GBSS 375-1000-02 | |
| Stir Plate | |||
| Synergy 4 Fluorometer | Biotek | ||
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
| V8 juice | Campbell's | ||
| Whatman Qualitative Grade Plain Sheets, Grade 3 | Fisher Scientific | 09-820P | |
| Wrist-Action Shaker | Burrell Scientific |
References
- Ismaiel, A., Papenbrock, J. Mycotoxins: Producing fungi and mechanisms of phytotoxicity. Agriculture. 5 (3), 492-537 (2015).
- Mitchell, N., Bowers, E., Hurburgh, C., Wu, F. Potential economic losses to the USA corn industry from aflatoxin contamination. Food Additives & Contaminants: Part A. 33 (3), 540-550 (2016).
- Umesha, S., Manukumar, H. M., Chandrasekhar, B., Shivakumara, P., Shiva Kumar, J., Raghava, S., Avinash, P., Shirin, M., Bharathi, T. R., Rajini, S. B., Nandhini, M., Vinaya Rani, G., Shobha, M., Prakash, H. S. Aflatoxins and food pathogens: Impact of biologically active aflatoxins and their control strategies. Journal of the Science of Food and Agriculture. , (2016).
- Brown, R. L., Menkir, A., Chen, Z. Y., Bhatnagar, D., Yu, J., Yao, H., Cleveland, T. E. Breeding aflatoxin-resistant maize lines using recent advances in technologies – a review. Food Additives & Contaminants – Part A Chemistry, Analysis, Control, Exposure & Risk Assessment. 30 (8), 1382-1391 (2013).
- Abbas, H., Accinelli, C., Shier, W. T. Biological control of aflatoxin contamination in U.S. crops and the use of bioplastic formulations of Aspergillus flavus biocontrol strains to optimize application strategies. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65, 7081-7087 (2017).
- Udomkun, P., Wiredu, A. N., Nagle, M., Müller, J., Vanlauwe, B., Bandyopadhyay, R. Innovative technologies to manage aflatoxins in foods and feeds and the profitability of application – A review. Food Control. 76, 127-138 (2017).
- Dohroo, N. P., Bhardwaj, S. S., Shyram, K. R. Amylase and invertase activity as influenced by Pythium pleroticum causing rhizome rot of ginger. Plant Disease Research. 2, 106-107 (1987).
- Singh, R., Saxena, V. S., Singh, R. Pectinolytic, cellulolytic, amylase and protease production by three isolates of Fusarium solani variable in their virulence. Indian Journal of Mycology and Plant Pathology. 19, 22-29 (1989).
- Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. Amy1, the α-amylase gene of Aspergillus flavus: Involvement in aflatoxin biosynthesis in maize kernels. Phytopathology. 89 (10), 908-914 (1999).
- Bluhm, B. H., Woloshuk, C. P. Amylopectin induces Fumonisin B1 production by Fusarium verticillioides during colonization of maize kernels. Molecular Plant-Microbe Interactions. 18 (12), 1333-1339 (2005).
- Gilbert, M. K., Majumdar, R., Rajasekaran, K., Chen, Z. Y., Wei, Q., Sickler, C. M., Lebar, M. D., Cary, J. W., Frame, B. R., Wang, K. RNA interference-based silencing of the a-amylase (amy1) gene in Aspergillus flavus decreases fungal growth and aflatoxin production in maize kernels. Planta. 247 (6), 1465-1473 (2018).
- Chen, Z. Y., Brown, R. L., Russin, J. S., Lax, A. R., Cleveland, T. E. A corn trypsin inhibitor with antifungal activity inhibits Aspergillus flavus α-amylase. Phytopathology. 89 (18944733), 902-907 (1999).
- Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. Inhibition of growth of Aspergillus flavus and fungal α-amylases by a lectin-like protein from Lablab purpureus. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (8), 955-961 (2001).
- Mirkov, T. E., Wahlstrom, J. M., Hagiwara, K., Finardi-Filho, F., Kjemtrup, S., Chrispeels, M. J. Evolutionary relationships among proteins in the phytohemagglutinin-arcelin-a-amylase inhibitor family of the common bean and its relatives. Plant Molecular Biology. 26 (4), 1103-1113 (1994).
- Kim, Y. H., Woloshuk, C. P., Cho, E. H., Bae, J. M., Song, Y. S., Huh, G. H. Cloning and functional expression of the gene encoding an inhibitor against Aspergillus flavus a-amylase, a novel seed lectin from Lablab purpureus (Dolichos lablab). Plant Cell Reports. 26 (4), 395-405 (2007).
- Frame, B., Main, M., Schick, R., Wang, K., Thorpe, T. A., Yeung, E. C. Ch. 22. Plant Embryo Culture. 710, 327-341 (2011).
- Rajasekaran, K., Sickler, C. M., Brown, R. L., Cary, J. W., Bhatnagar, D. Evaluation of resistance to aflatoxin contamination in kernels of maize genotypes using a GFP-expressing Aspergillus flavus strain. World Mycotoxin Journal. 6 (2), 151-158 (2013).
- Rajasekaran, K., Sayler, R. J., Sickler, C. M., Majumdar, R., Jaynes, J. M., Cary, J. W. Control of Aspergillus flavus growth and aflatoxin production in transgenic maize kernels expressing a tachyplesin-derived synthetic peptide, AGM182. Plant Science. , 150-156 (2018).
- Shu, X., Livingston, D. P., Franks, R. G., Boston, R. S., Woloshuk, C. P., Payne, G. A. Tissue-specific gene expression in maize seeds during colonization by Aspergillus flavus and Fusarium verticillioides. Molecular Plant Pathology. 16 (4), 662-674 (2015).
- Savary, S., Ficke, A., Aubertot, J. -. N., Hollier, C. Crop losses due to diseases and their implications for global food production losses and food security. Food Security. 4, 519-537 (2012).
- Damalas, C. A., Eleftherohorinos, I. G. Pesticide exposure, safety issues, and risk assessment indicators. International Journal of Environmental Research and Public Health. 8 (5), 1402-1419 (2011).
- Kowalska, A., Walkiewicz, K., Kozieł, P., Muc-Wierzgoń, M. Aflatoxins: Characterisitcs and impact on human health. Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej (Online). 71, 315-327 (2017).
- Rajasekaran, K., Cary, J. W., Cotty, P. J., Cleveland, T. E. Development of a GFP-expressing Aspergillus flavus strain to study fungal invasion, colonization, and resistance in cottonseed. Mycopathologia. 165 (2), 89-97 (2008).
- Punt, P., Dingemanse, M. A., Kuyvenhoven, A., Soede, R. D., Pouwels, P. H., van den Hondel, C. A. Functional elements in the promoter region of the Aspergillus nidulans gpdA gene encoding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Gene. 93 (1), 101-109 (1990).
- Lee, L. W., Chiou, C. H., Klomparens, K. L., Cary, J. W., Linz, J. E. Subcellular localization of aflatoxin biosynthetic enzymes Nor-1, Ver-1, and OmtA in time-dependent fractionated colonies of Aspergillus parasiticus. Archives of Microbiology. 181 (3), 204-214 (2004).
- Bhatnagar, D., Cary, J. W., Ehrlich, K., Yu, J., Cleveland, T. E. Understanding the genetics of regulation of aflatoxin production and Aspergillus flavus development. Mycopathologia. 162, 155-166 (2006).
- Williams, W. P., Krakowsky, M. D., Scully, B. T., Brown, R. L., Menkir, A., Warburton, M. L., Windham, G. L. Identifying and developing maize germplasm with resistance to accumulation of aflatoxins. World Mycotoxin Journal. 8 (2), 193-209 (2015).
- Broekaert, W. F., van Parijs, J., Leyns, F., Joos, H., Peumans, W. J. A chitin-binding lectin from stinging nettle rhizomes with antifungal properties. Science. 245 (4922), 1100-1102 (1989).
- Vanparijs, J., Broekaert, W. F., Goldstein, I. J., Peumans, W. J. Hevein-an antifungal protein from rubber-tree (Hevea brasiliensis) latex. Planta. 183, 258-264 (1991).
- Gozia, O., Ciopraga, J., Bentia, T., Lungu, M., Zamfirescu, I., Tudor, R., Roseanu, A., Nitu, F. Antifungal properties of lectin and new chitinases from potato tubers. Comptes Rendus de l’Academie des Sciences – Series III. 316 (8), 788-792 (1993).
- Wisessing, A., Choowongkomon, K. Amylase inhibitors in plants: Structures, Functions and Applications. Functional Plant Science and Biotechnology. 6 (1), 31-41 (2012).
- Tyagi, B., Trivedi, N., Dubey, A. a-amylase inhibitor: A compelling plant defense mechanism against insect/pests. Environment & Ecology. 32 (3), 995-999 (2014).
- Powers, J. R., Culbertson, J. D. In vitro effect of bean amylase inhibitor on insect amylases. Journal of Food Protection. 45, 655-657 (1982).
- Gatehouse, A. M. R., Fenton, K. A., Jepson, I., Pavey, D. J. The effects of a-amylase inhibitors on insect storage pests: Inhibition of a-amylase in vitro and effects on development in vivo. Journal of the Science of Food and Agriculture. 37, 727-734 (1986).
- Blanco-Labra, A., Chagolla-Lopez, A., Martinez-Gallardo, N., Valdes-Rodriguez, S. Further characterization of the 12-kDa protease a-amylase inhibitor present in maize seeds. Journal of Food Biochemistry. 19, 27-41 (1995).
- Abdollahi, A., Buchanan, R. L. Regulation of aflatoxin biosynthesis: Induction of aflatoxin production by various carbohydrates. Journal of Food Science. 46, 633-635 (1981).
- Liu, J., Sun, L., Zhang, N., Zhang, J., Guo, J., Li, C., Rajput, S. A., Qi, D. Effects of nutrients in substrates of different grains on aflatoxin B1 production by Aspergillus flavus. BioMed Research International. 2016, (2016).
- Uppala, S. S., Bowen, K. L., Woods, F. M. Pre-harvest aflatoxin contamination and soluble sugars of peanut. Peanut Science. 40 (1), 40-51 (2013).
