עיכוב של צמיחה אספרגילוס flavus Aflatoxin ייצור הטרנסגניים תירס לבטא מעכב α-עמילאז מן Lablab purpureus ל'
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול לנתח אספרגילוס flavus צמיחה וייצור aflatoxin ב תירס גרעינים ביטוי של חלבונים נגד פטריות. באמצעות זן GFP-לבטא flavus א לנו פיקוח זיהום או התפשטות הפטרייה ב גרעינים בוגרת בזמן אמת. וזמינותו היא מהירה, אמינה, לשחזור.
Abstract
Aflatoxin זיהום בגידולים ואוכל הזנה היא אתגר גדול ברחבי העולם. Aflatoxins, המיוצר על ידי הפטריה אספרגילוס flavus (flavus א) הם קרצינוגנים, המפחיתים באופן משמעותי חיתוך הערך בשדה תירס וגידולים אחרים שמן עשיר כמו בוטנים חוץ פוזות איום רציני לבריאות האדם ושל בעלי החיים. גישות שונות, כולל הרבייה המסורתיים, ביטוי הטרנסגניים ההתנגדות קשורה חלבונים ו RNA הפרעה (RNAi)-מבוסס מארח-induced ג’ין להחרשת הקריטיים flavus ע’ ג’ין מטרות, להיות מוערכים להגדיל aflatoxin עמידות גידולים רגישים. מחקרים שנעשו בעבר הראו תפקיד חשוב של α-עמילאז הייצור הפתוגנזה ו aflatoxin א flavus , מציע הגן/אנזים זה הוא מטרה אפשרית כדי להפחית flavus א צמיחה וייצור aflatoxin. בהקשר זה, המחקר הנוכחי נערך כדי להעריך ביטוי heterologous (תחת שליטה של האמרגן 35S קונסטיטוטיביות CaMV) Lablab purpureus ל’ α-עמילאז דמוי מעכב חלבון (AILP) תירס נגד flavus א. AILP הוא חלבון 36-kDa, אשר מעכב תחרותי של האנזים α-עמילאז flavus א , שייך למשפחת חלבון מעכב לקטין – arcelin – α-עמילאז במשותף שעועית. מחקרים במבחנה לפני העבודה הנוכחית הייתה הפגינו את התפקיד של AILP בעיכוב של צמיחה פטרייתי ופעילות של α-עמילאז flavus א . צמיחה פטרייתי וייצור aflatoxin ב גרעינים בוגרת נוטרו בזמן אמת באמצעות זן GFP-לבטא flavus א . הגרעין הקרנת assay (קרית גת) הוא מאוד פשוט להגדיר ומספק אמין לשחזור נתונים על זיהום ואת מידת התפשטות זה יכול ניתן לכמת להערכת germplasm וקווים מהונדס. בגלל הלחץ GFP הוא צמיחה בקורלציה מקרוב פטרייתי וזה, לפי סיומת, מתואם היטב לערכים aflatoxin. מטרת העבודה הנוכחית הייתה ליישם את הידע הקודם הזה ב יבול מסחרי חשוב כמו חיטה כדי להגדיל את ההתנגדות aflatoxin. התוצאות שלנו מראים הפחתה 35% – 72% צמיחה flavus א AILP-ביטוי הטרנסגניים תירס גרעינים אשר, בתורו, מתורגם הפחתה 62% – 88% ברמות aflatoxin.
Introduction
Mycotoxin זיהום על ידי סוגים פטריות, אספרגילוס, Fusarium, Penicilliumו Alternaria היא בעיה רצינית של מזון ולהאכיל יבולים גדולים ברחבי העולם1,2,3. בין אלה שזקוקים, אספרגילוס יש את השפעה שלילית הגבוה ביותר על ערך היבול ובריאות האדם ושל בעלי החיים. אספרגילוס flavus (א flavus) הוא פתוגן הזדמנותית הצמח משפיע על יבול עשיר שמן כגון תירס, זרעי כותנה, בוטנים, מייצרת את קרצינוגנים, aflatoxins, כמו גם רבים רעילים מטבוליטים משניים (SMs). תירס האוכל חשוב להאכיל הגידול ברחבי העולם ו נמצא רגישים מאוד זיהום על-ידי flavus א. ההשפעה הכלכלית של זיהום aflatoxin-מאבד ערך מופחת ב תירס יכול להיות ככל 686.6 מיליון דולר לשנה בארה ב2 עם השינויים החזויים באקלים העולמי, ההשפעה של aflatoxins יכול לגרום הפסדים כלכליים רבתי ב תירס עם הערכות גבוה כמו 1.68 מיליארד דולר לשנה בעתיד הקרוב2. נתון כלכלי ובריאות להשפעות של aflatoxins בני אדם, חיות משק, שליטה aflatoxin קדם קציר תירס עשוי להיות הדרך היעילה ביותר כדי למנוע זיהום aflatoxin מזון, מוצרים.
הגישה ובקרה הקציר מראש גדול עבור עמידות aflatoxin תירס היה בשימוש נרחב של העשורים האחרונים היא בעיקר באמצעות רבייה, אשר דורשת כמות משמעותית של זמן4. לאחרונה, הייצור יש לו הצלחות בהפחתה aflatoxin בקנה מידה גדול שדה יישומים5,6. מלבד/מוצרים חדשים, יישום של כלים חדשניות כגון ‘המארח המושרה ג’ין להחרשת’ (HIGS) דרך RNAi וביטוי הטרנסגניים של חלבונים הקשורים בהתנגדות יש לו הצלחות בהפחתה של צמיחה flavus א aflatoxin ייצור במחקרים מעבדה ושדה בקנה מידה קטן. גישות אלה כעת להיות ממוטבים בנוסף לזיהוי מטרות ג’ין flavus א פוטנציאלי חדש עבור מניפולציה בעתיד.
מלבד גנים המעורבים ישירות בייצור mycotoxin בתור מטרות פוטנציאליות של אסטרטגיות שליטה מהונדס, הוכחו amylases פטרייתי לשחק תפקיד חיוני בשמירה על הפקה מוצלחת הפתוגנזה ו mycotoxin במהלך השלבים המוקדמים לזיהום הצמח הפונדקאי. כמה דוגמאות Pythium pleroticum (סוכן סיבתי של ריקבון קנה שורש ג’ינג’ר), Fusarium solani (סוכן סיבתי של כרובית ווילט), איפה מתאמים חיוביים בין פתוגניות והביטוי α-עמילאז ופעילות נצפו 7,8. עיכוב של פעילות α-עמילאז או באמצעות נוקאאוט גנטי או גישות תמונות ציפורים משפיע באופן שלילי צמיחה פטרייתי וייצור הרעלן. מוטציה נוקאאוט α-עמילאז של flavus א לא הצליח לייצר aflatoxins כאשר גדל עמילן המצע או degermed תירס גרעינים9. באופן דומה, ב- Fusarium verticillioides זן נוקאאוט α-עמילאז הצליחה לייצר fumonisin B1 (mycotoxin) במהלך זיהום של תירס גרעינים10. במחקר עדכני יותר, הפגינו גילברט et al. (2018) מבוסס-RNAi דפיקה למטה של הביטוי α-עמילאז flavus א HIGS. הקטינה באופן משמעותי את ייצור צמיחה, aflatoxin flavus א במהלך זיהום גרעיני תירס11 .
מעכבים ספציפיים של פעילות α-עמילן יש גם הפיק תוצאות דומות כמו המתקבל למטה-רגולציה של הביטוי α-עמילאז. הדוח הראשון את התפקיד של מעכב α-עמילאז בהתנגדות פטרייתי הגיעה בידוד ואפיון של מעכב טריפסין-α-עמילאז 14-kDa משורות תירס עמידים בפני flavus א12. בהמשך הקרנת הסרט כמה מאות מיני צמחים על-ידי Fakhoury Woloshuk להביא לאיתורם של חלבון מעכב דמוי α-עמילאז (AILP) 36-kDa מהזרעים של יקינתון שעועית, ל’ Lablab purpureus 13. רצף פפטיד לקטינים AILP דמה השייכים למשפחת מעכבי לקטין – arcelin – α-עמילאז דיווח במשותף שעועית14,15. AILP מטוהרים התערוכה לא כל פעילות המעכבת לכיוון בתרבית של טריפסין ואפיון נוסף במבחנה הראו עיכוב משמעותי של נביטה conidial13וצמיחה של flavus א . דוחות שהוצגו כאן בבירור מראה α-עמילאז יכול לשמש מטרה בבקרת גישות להגבלת פתוגנים או מזיקים תלויים גיוס עמילן (באמצעות פעילות עמילאז-α) ורכישה של סוכרים מסיסים כמקור אנרגיה בזמן שלהם פתוגניים אינטראקציה עם צמחים פונדקאים.
אלפא-עמילאז ידוע להיות הקריטיים flavus ע’ פתוגניות9,10,11, ונתן את החשיבות של AILP כמו אנטי חזק-הסוכן (α-עמילאז עיכוב/antigrowth)flavus א 13, יצרנו צמחי תירס מהונדס לבטא Lablab AILP ג’ין תחת האמרגן CaMV 35S מכוננת. המטרה היא לחקור אם ביטוי heterologous של זה מעכב α-עמילאז ב תירס הוא יעיל נגד ייצור פתוגנזה, aflatoxin flavus א במהלך זיהום גרעיני תירס. התוצאות שלנו מדגימים כי הגרעינים תירס מהונדס לבטא את AILP באופן משמעותי צמצם ייצור צמיחה, aflatoxin flavus א במהלך זיהום ליבה.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההפסדים בגידולים חקלאיים בשל פתוגנים מזיקים היא בעיה עולמית20. כיום, יישום של קוטלי פטריות סינטטיים וחומרי הדברה הוא האמצעי השולט על השליטה פתוגנים צמח ומזיקים, אבל שאריות רעילות של אלה ביוכימיקלים ב ואוכל הזנה יכול להוות איום רציני לבריאות האדם ושל בעלי החיים21. ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים דוד Meints, אוניברסיטת ארקנסו שלו לסיוע בפיתוח ובניתוח של תירס מהונדס במהלך הדורות הראשונים. עבודה זו קיבל סיוע כספי של משרד החקלאות-ARS כריס פרוייקט 6054-42000-025-00D. איזכור שמות מסחריים או מוצרים מסחריים במאמר זה היא אך ורק לצורך אספקת מידע ספציפי, לא משתמע המלצה או אישור מאת לנו משרד החקלאות. מדיניות הזדמנות שווה בתעסוקה (EEO) של משרד החקלאות-ARS מנדטים שוויון הזדמנויות לכל האנשים, אוסר על אפליה בכל ההיבטים של אנשי מדיניות, שיטות ופעולות של הסוכנות.
Materials
| Agar | Caisson | ||
| Amazing Marine Goop | Eclectic Products | ||
| C1000 Touch CFX96 Real-Time System | Bio-Rad | ||
| Corning Falcon Tissue Culture Dishes, 60 mm | Fisher Scientific | 08-772F | |
| Eppendorf 5424 Microcentrifuge | Fisher Scientific | ||
| Erlenmeyer flask with stopper, 50 mL | Ace Glass | 6999-10 | |
| Ethanol | |||
| FluoroQuant Afla | Romer Labs | COKFA1010 | |
| Fluted Qualitative Filter Paper Circles, 15 cm | Fisher Scientific | 09-790-14E | |
| Force Air Oven | VWR | ||
| FQ-Reader | Romer Labs | EQFFM3010 | |
| Geno/Grinder 2010 | OPS Diagnostics | SP 2010-115 | |
| Innova 44 Incubator Shaker | Brunswick Scientific | ||
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | |
| liquid Nitrogen | |||
| Low Form Griffin Beakers, 100 mL | DKW Life Sciences | 14000-100 | |
| Methanol | |||
| Methylene Chloride | |||
| Nexttec 1-step DNA Isolation Kit for Plants | Nexttec | 47N | |
| Nikon Eclipse E600 microscope with Nikon DS-Qi1 camera | Nikon | ||
| Nikon SMZ25 stereomicroscope with C-HGFI Episcopic Illuminator and Andor Zyla 4.2 sCMOS camera | Nikon | ||
| Nunc Square BioAssay Dishes | ThermoFisher Scientific | 240835 | |
| Phire Plant Direct PCR Kit | ThermoFisher Scientific | F130WH | |
| Polycarbonate Vials, 15 ml | OPS Diagnostics | PCRV 15-100-23 | |
| Potato Dextrose Broth | |||
| Snap Cap, 22 mm | DKW Life Sciences | 242612 | |
| Sodium Phosphate dibasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium Phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | ||
| Spectrum Plant Total RNA Kit | Sigma-Aldrich | STRN50 | |
| Stainless Steel Grinding Balls, 3/8'' | OPS Diagnostics | GBSS 375-1000-02 | |
| Stir Plate | |||
| Synergy 4 Fluorometer | Biotek | ||
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
| V8 juice | Campbell's | ||
| Whatman Qualitative Grade Plain Sheets, Grade 3 | Fisher Scientific | 09-820P | |
| Wrist-Action Shaker | Burrell Scientific |
References
- Ismaiel, A., Papenbrock, J. Mycotoxins: Producing fungi and mechanisms of phytotoxicity. Agriculture. 5 (3), 492-537 (2015).
- Mitchell, N., Bowers, E., Hurburgh, C., Wu, F. Potential economic losses to the USA corn industry from aflatoxin contamination. Food Additives & Contaminants: Part A. 33 (3), 540-550 (2016).
- Umesha, S., Manukumar, H. M., Chandrasekhar, B., Shivakumara, P., Shiva Kumar, J., Raghava, S., Avinash, P., Shirin, M., Bharathi, T. R., Rajini, S. B., Nandhini, M., Vinaya Rani, G., Shobha, M., Prakash, H. S. Aflatoxins and food pathogens: Impact of biologically active aflatoxins and their control strategies. Journal of the Science of Food and Agriculture. , (2016).
- Brown, R. L., Menkir, A., Chen, Z. Y., Bhatnagar, D., Yu, J., Yao, H., Cleveland, T. E. Breeding aflatoxin-resistant maize lines using recent advances in technologies – a review. Food Additives & Contaminants – Part A Chemistry, Analysis, Control, Exposure & Risk Assessment. 30 (8), 1382-1391 (2013).
- Abbas, H., Accinelli, C., Shier, W. T. Biological control of aflatoxin contamination in U.S. crops and the use of bioplastic formulations of Aspergillus flavus biocontrol strains to optimize application strategies. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65, 7081-7087 (2017).
- Udomkun, P., Wiredu, A. N., Nagle, M., Müller, J., Vanlauwe, B., Bandyopadhyay, R. Innovative technologies to manage aflatoxins in foods and feeds and the profitability of application – A review. Food Control. 76, 127-138 (2017).
- Dohroo, N. P., Bhardwaj, S. S., Shyram, K. R. Amylase and invertase activity as influenced by Pythium pleroticum causing rhizome rot of ginger. Plant Disease Research. 2, 106-107 (1987).
- Singh, R., Saxena, V. S., Singh, R. Pectinolytic, cellulolytic, amylase and protease production by three isolates of Fusarium solani variable in their virulence. Indian Journal of Mycology and Plant Pathology. 19, 22-29 (1989).
- Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. Amy1, the α-amylase gene of Aspergillus flavus: Involvement in aflatoxin biosynthesis in maize kernels. Phytopathology. 89 (10), 908-914 (1999).
- Bluhm, B. H., Woloshuk, C. P. Amylopectin induces Fumonisin B1 production by Fusarium verticillioides during colonization of maize kernels. Molecular Plant-Microbe Interactions. 18 (12), 1333-1339 (2005).
- Gilbert, M. K., Majumdar, R., Rajasekaran, K., Chen, Z. Y., Wei, Q., Sickler, C. M., Lebar, M. D., Cary, J. W., Frame, B. R., Wang, K. RNA interference-based silencing of the a-amylase (amy1) gene in Aspergillus flavus decreases fungal growth and aflatoxin production in maize kernels. Planta. 247 (6), 1465-1473 (2018).
- Chen, Z. Y., Brown, R. L., Russin, J. S., Lax, A. R., Cleveland, T. E. A corn trypsin inhibitor with antifungal activity inhibits Aspergillus flavus α-amylase. Phytopathology. 89 (18944733), 902-907 (1999).
- Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. Inhibition of growth of Aspergillus flavus and fungal α-amylases by a lectin-like protein from Lablab purpureus. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (8), 955-961 (2001).
- Mirkov, T. E., Wahlstrom, J. M., Hagiwara, K., Finardi-Filho, F., Kjemtrup, S., Chrispeels, M. J. Evolutionary relationships among proteins in the phytohemagglutinin-arcelin-a-amylase inhibitor family of the common bean and its relatives. Plant Molecular Biology. 26 (4), 1103-1113 (1994).
- Kim, Y. H., Woloshuk, C. P., Cho, E. H., Bae, J. M., Song, Y. S., Huh, G. H. Cloning and functional expression of the gene encoding an inhibitor against Aspergillus flavus a-amylase, a novel seed lectin from Lablab purpureus (Dolichos lablab). Plant Cell Reports. 26 (4), 395-405 (2007).
- Frame, B., Main, M., Schick, R., Wang, K., Thorpe, T. A., Yeung, E. C. Ch. 22. Plant Embryo Culture. 710, 327-341 (2011).
- Rajasekaran, K., Sickler, C. M., Brown, R. L., Cary, J. W., Bhatnagar, D. Evaluation of resistance to aflatoxin contamination in kernels of maize genotypes using a GFP-expressing Aspergillus flavus strain. World Mycotoxin Journal. 6 (2), 151-158 (2013).
- Rajasekaran, K., Sayler, R. J., Sickler, C. M., Majumdar, R., Jaynes, J. M., Cary, J. W. Control of Aspergillus flavus growth and aflatoxin production in transgenic maize kernels expressing a tachyplesin-derived synthetic peptide, AGM182. Plant Science. , 150-156 (2018).
- Shu, X., Livingston, D. P., Franks, R. G., Boston, R. S., Woloshuk, C. P., Payne, G. A. Tissue-specific gene expression in maize seeds during colonization by Aspergillus flavus and Fusarium verticillioides. Molecular Plant Pathology. 16 (4), 662-674 (2015).
- Savary, S., Ficke, A., Aubertot, J. -. N., Hollier, C. Crop losses due to diseases and their implications for global food production losses and food security. Food Security. 4, 519-537 (2012).
- Damalas, C. A., Eleftherohorinos, I. G. Pesticide exposure, safety issues, and risk assessment indicators. International Journal of Environmental Research and Public Health. 8 (5), 1402-1419 (2011).
- Kowalska, A., Walkiewicz, K., Kozieł, P., Muc-Wierzgoń, M. Aflatoxins: Characterisitcs and impact on human health. Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej (Online). 71, 315-327 (2017).
- Rajasekaran, K., Cary, J. W., Cotty, P. J., Cleveland, T. E. Development of a GFP-expressing Aspergillus flavus strain to study fungal invasion, colonization, and resistance in cottonseed. Mycopathologia. 165 (2), 89-97 (2008).
- Punt, P., Dingemanse, M. A., Kuyvenhoven, A., Soede, R. D., Pouwels, P. H., van den Hondel, C. A. Functional elements in the promoter region of the Aspergillus nidulans gpdA gene encoding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Gene. 93 (1), 101-109 (1990).
- Lee, L. W., Chiou, C. H., Klomparens, K. L., Cary, J. W., Linz, J. E. Subcellular localization of aflatoxin biosynthetic enzymes Nor-1, Ver-1, and OmtA in time-dependent fractionated colonies of Aspergillus parasiticus. Archives of Microbiology. 181 (3), 204-214 (2004).
- Bhatnagar, D., Cary, J. W., Ehrlich, K., Yu, J., Cleveland, T. E. Understanding the genetics of regulation of aflatoxin production and Aspergillus flavus development. Mycopathologia. 162, 155-166 (2006).
- Williams, W. P., Krakowsky, M. D., Scully, B. T., Brown, R. L., Menkir, A., Warburton, M. L., Windham, G. L. Identifying and developing maize germplasm with resistance to accumulation of aflatoxins. World Mycotoxin Journal. 8 (2), 193-209 (2015).
- Broekaert, W. F., van Parijs, J., Leyns, F., Joos, H., Peumans, W. J. A chitin-binding lectin from stinging nettle rhizomes with antifungal properties. Science. 245 (4922), 1100-1102 (1989).
- Vanparijs, J., Broekaert, W. F., Goldstein, I. J., Peumans, W. J. Hevein-an antifungal protein from rubber-tree (Hevea brasiliensis) latex. Planta. 183, 258-264 (1991).
- Gozia, O., Ciopraga, J., Bentia, T., Lungu, M., Zamfirescu, I., Tudor, R., Roseanu, A., Nitu, F. Antifungal properties of lectin and new chitinases from potato tubers. Comptes Rendus de l’Academie des Sciences – Series III. 316 (8), 788-792 (1993).
- Wisessing, A., Choowongkomon, K. Amylase inhibitors in plants: Structures, Functions and Applications. Functional Plant Science and Biotechnology. 6 (1), 31-41 (2012).
- Tyagi, B., Trivedi, N., Dubey, A. a-amylase inhibitor: A compelling plant defense mechanism against insect/pests. Environment & Ecology. 32 (3), 995-999 (2014).
- Powers, J. R., Culbertson, J. D. In vitro effect of bean amylase inhibitor on insect amylases. Journal of Food Protection. 45, 655-657 (1982).
- Gatehouse, A. M. R., Fenton, K. A., Jepson, I., Pavey, D. J. The effects of a-amylase inhibitors on insect storage pests: Inhibition of a-amylase in vitro and effects on development in vivo. Journal of the Science of Food and Agriculture. 37, 727-734 (1986).
- Blanco-Labra, A., Chagolla-Lopez, A., Martinez-Gallardo, N., Valdes-Rodriguez, S. Further characterization of the 12-kDa protease a-amylase inhibitor present in maize seeds. Journal of Food Biochemistry. 19, 27-41 (1995).
- Abdollahi, A., Buchanan, R. L. Regulation of aflatoxin biosynthesis: Induction of aflatoxin production by various carbohydrates. Journal of Food Science. 46, 633-635 (1981).
- Liu, J., Sun, L., Zhang, N., Zhang, J., Guo, J., Li, C., Rajput, S. A., Qi, D. Effects of nutrients in substrates of different grains on aflatoxin B1 production by Aspergillus flavus. BioMed Research International. 2016, (2016).
- Uppala, S. S., Bowen, K. L., Woods, F. M. Pre-harvest aflatoxin contamination and soluble sugars of peanut. Peanut Science. 40 (1), 40-51 (2013).
