In vivo calcium Imaging i C. elegans krop væg muskler
Summary
Denne metode giver en måde at par optogenetics og genetisk kodet calcium sensorer til billede baseline cytosolisk calcium niveauer og ændringer i fremkaldte calcium transienter i kroppen væg muskler af model organismen C. elegans.
Abstract
Den model organisme C. elegans giver et fremragende system til at udføre in vivo calcium Imaging. Dens gennemsigtige krop og genetiske manipulerbarhed giver mulighed for målrettet ekspression af genetisk kodede calcium sensorer. Denne protokol skitserer brugen af disse sensorer til in vivo billeddannelse af calcium dynamik i målrettede celler, specifikt kroppens væg muskler af orme. Ved at udnytte Co-ekspression af præsynaptic channelrhodopsin, stimulering af acetylcholin frigivelse fra excitatoriske motor neuroner kan induceres ved hjælp af blå lys impulser, resulterer i muskel depolarisering og reproducerbare ændringer i cytoplasmisk calcium Niveauer. To orm immobilisering teknikker diskuteres med varierende sværhedsgrader. En sammenligning af disse teknikker viser, at begge metoder bevarer det neuromuskulære omvejnings fysiologi og muliggør reproducerbar kvantificering af calcium transienter. Ved parring optogenetics og funktionelle calcium Imaging, ændringer i post Synaptic calcium håndtering og homøostase kan evalueres i en række mutante baggrunde. Data præsenteret validerer både immobilisering teknikker og specifikt undersøger rollerne af C. elegans sarco (endo) plasmic retikulære calcium ATPase og Calcium-aktiverede BK kalium kanal i kroppen væg muskel calcium forordning.
Introduction
Dette papir præsenterer metoder til in vivo calcium Imaging af C. elegans kropsvæg muskler ved hjælp af optogenetisk neuronal stimulation. Parring af en muskel udtrykte genetisk kodet calcium indikator (GECI) med blåt lys udløst neuronal depolarisering og giver et system til klart at observere de fremkaldte postsynaptiske calcium transienter. Dette undgår brugen af elektrisk stimulation, tillader en ikke-invasiv analyse af mutanter påvirker den postsynaptiske calcium dynamik.
Enkelt-fluorophore GECIs, såsom GCaMP, bruger et enkelt fluorescerende protein molekyle smeltet til M13 domæne af myosin lyskæde kinase ved sin N-terminal ende og calmodulin (CaM) på C-Terminus. Ved calcium binding gennemgår CaM-domænet, som har en høj affinitet for calcium, en konformationel ændring, der inducerer en efterfølgende konformationel ændring i det fluorescerende protein, hvilket fører til en stigning i fluorescens intensitet1. GCaMP Fluorescens er spændt på 488 nm, hvilket gør det uegnet til at blive brugt i forbindelse med channelrhodopsin, som har en lignende excitation bølgelængde på 473 nm. Således, for at par calcium målinger med channelrhodopsin stimulation, det grønne fluorescerende protein af GCaMP skal udskiftes med et rødt fluorescerende protein, mRuby (RCaMP). Ved hjælp af musklen udtrykte RCaMP, i kombination med den kolinerge motor neuron ekspression af channelrhodopsin, tillader undersøgelser på ormen neuromuskulære Junction (NMJ) med samtidig brug af optogenetik og funktionel billeddannelse inden for samme dyr 2.
Brugen af channelrhodopsin omgår behovet for elektrisk stimulation til at depolarisere de neuromuskulære kryds af C. elegans, som kun kan opnås i dissekeret præparater, hvilket gør denne teknik både lettere at ansætte og mere præcis ved målretning af specifikke væv. For eksempel, channelrhodopsin er tidligere blevet brugt i C. elegans at reversibelt aktivere specifikke neuroner, fører til enten robust aktivering af excitatoriske eller hæmmende neuroner3,4. Brugen af lys-stimuleret depolarisering også omgår spørgsmålet om neuronal skade på grund af den direkte elektriske stimulation. Dette giver mulighed for at undersøge virkningerne af mange forskellige stimulerings protokoller, herunder vedvarende og gentagne stimuleringer, på postsynaptisk calcium dynamik4.
C. elegans ‘ gennemsigtige karakter gør den ideel til den funktionelle analyse af fluorescerende billeder. Men, når stimulere excitatoriske acetylcholin neuroner på NMJ, dyr forventes at reagere med en umiddelbar muskelsammentrækning4, gør immobilisering af orme kritisk i visualisering af diskrete calcium ændringer. Traditionelt er farmakologiske midler blevet brugt til at lamme dyrene. En sådan stof anvendes er levamisole, en kolinerge acetylcholin receptor agonist5,6,7. Da levamisol fører til vedvarende aktivering af en under type af excitatoriske muskel receptorer, er dette reagens uegnet til studiet af muskel calcium dynamikken. Virkningen af levamisol inducerer postsynaptisk depolarisering, opløstende cytosolisk calcium, og occherunder observationer efter præsynaptisk stimulation. For at undgå brug af paralyserende lægemidler, vi undersøgte to alternative metoder til at immobilisere C. elegans. Dyr blev enten limet ned og derefter dissekeret åben for at udsætte kroppen væg muskler, svarende til den eksisterende C. elegans nmj Elektrofysiologi metode8, eller nanobeads blev brugt til at imprere intakte dyr9. Begge procedurer tilladt for reproducerbare målinger af hvile og fremkaldte muskel calcium transienter, der var let kvantificerbare.
Metoderne i dette papir kan bruges til at måle baseline cytosolisk calcium niveauer og transienter i postsynaptiske kropsvæg muskelceller i C. elegans. Eksempler på data, der anvender de to forskellige immobilisering teknikker er givet. Begge teknikker drage fordel af optogenetics at depolarisere muskelcellerne uden brug af elektrisk stimulation. Disse eksempler demonstrere gennemførligheden af denne metode i vurderingen af mutationer, der påvirker postsynaptisk calcium håndtering i orme og påpege fordele og ulemper ved de to immobilisering tilgange.
Protocol
Representative Results
Discussion
GECIs er et kraftfuldt værktøj i C. elegans neurobiologi. Tidligere arbejde har udnyttet calcium Imaging teknikker til at undersøge en bred vifte af funktioner i både neuroner og muskelceller, herunder sensoriske og adfærdsmæssige reaktioner, med varierede metoder til stimulation. Nogle undersøgelser har brugt kemiske stimuli til at udløse calcium transienter i sensoriske aske neuroner22,23 eller til at fremkalde calcium bølger i faryngealt musk…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Dr. Alexander Gottschalk for ZX1659, RCaMP og channelrhodopsin indeholdende orm stamme, Dr. Hongkyun Kim for SLO-1 (eg142) orm stamme, og det nationale Bioresource projekt for SCA-1 (tm5339) orm stamme.
Materials
| all-trans retinal | Sigma-Aldrich | R2500 | Necessary for excitation of channel rhodopsin |
| Amber LED | RCaMP illumination | ||
| Arduino UNO | Mouser | 782-A000066 | Controls fluorescence illumination |
| Blue LED | channelrhodopsin illumination | ||
| BX51WI microscope | Olympus | Fixed state compound microscope | |
| Current controlled low noise linear power supply | Ametek | Sorenson | Controls LED intensity |
| Igor Pro | Wavemetrics | Wavemetrics.com | Graphing software |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov | Image processing software |
| LUMFLN 60x water NA 1.4 | Olympus | Water immersion objective for dissected preparation | |
| Master-8 Stimulator | A.M.P.I | Master timer for image acquisition and LED illumination | |
| Micro-Manager | micro-manager.org | Controls camera acquisition and LED excitiation | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
| pco.edge 4.2 CMOS camera | pco. | 4.2 | High-speed camera |
| PlanApo N 60x oil NA 1.4 | Olympus | Oil immersion objective for nanobead preparation | |
| Polybead microspheres | Polysciences, Inc. | 00876-15 | For worm immobilization |
| solid state switches | Sensata Technologies | Crydom CMX100D6 | Controls timing of LED illumination |
| Transgenic strain, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | SY1627 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with SERCA mutant allele |
| Transgenic strain, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with calcium-activated BK potassium channel mutant allele | |
| Transgeneic strain, [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Gottschalk Lab | ZX1659 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line |
References
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 1-29 (2013).
- Nagel, G., et al. Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses. Current Biology. 15 (24), 2279-2284 (2005).
- Liewald, J. F., et al. Optogenetic analysis of synaptic function. Nature Methods. 5 (10), 895-902 (2008).
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. Laser Microsurgery in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biology. 107, 177-206 (2012).
- Lewis, J. A., et al. Cholinergic Receptor Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 7 (10), 3059-3071 (1987).
- Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 95 (4), 905-928 (1980).
- Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature Neuroscience. 9, 791-798 (1999).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-Term Imaging of Caenorhabditis elegans Using Nanoparticle-Mediated Immobilization. PLoS ONE. 8 (1), 1-6 (2013).
- Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using umanager. Current Protocols in Molecular Biology. (Suppl 92), 1-17 (2010).
- Richmond, J. Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction. Journal of Visualized Experiments. (24), 1-4 (2009).
- Hoon Cho, J., Bandyopadhyay, J., Lee, J., Park, C. S., Ahnn, J. Two isoforms of sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) are essential in Caenorhabditis elegans. Gene. 261, 211-219 (2000).
- Zwaal, R. R., et al. The Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+ ATPase Is Required for Development and Muscle Function in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 276 (47), 43557-43563 (2001).
- Stammers, A. N., et al. The regulation of sarco(endo)plasmic reticulum calcium-ATPases (SERCA). Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 93, 1-12 (2015).
- Clapham, D. E. Calcium Signaling. Cell. 131, 1047-1058 (2007).
- Hovnanian, A. Serca pumps and human diseases. Calcium Signalling and Disease: Molecular Pathology of Calcium. , 337-363 (2007).
- Periasamy, M., Kalyanasundaram, A. SERCA pump isoforms: Their role in calcium transport and disease. Muscle and Nerve. 35 (4), 430-442 (2007).
- Gehlert, S., Bloch, W., Suhr, F. Ca2+-Dependent Regulations and Signaling in Skeletal Muscle: From Electro-Mechanical Coupling to Adaptation. International Journal of Molecular Sciences. 16, 1066-1095 (2015).
- Martin, A. A., Richmond, J. E. The sarco(endo)plasmic reticulum calcium ATPase SCA-1 regulates the Caenorhabditis elegans nicotinic acetylcholine receptor ACR-16. Cell Calcium. 72, 104-115 (2018).
- Wang, Z., Saifee, O., Nonet, M. L., Salkoff, L. SLO-1 Potassium Channels Control Quantal Content of Neurotransmitter Release at the C. elegans Neuromuscular Junction. Neuron. 32, 867-881 (2001).
- Abraham, L. S., Oh, H. J., Sancar, F., Richmond, J. E., Kim, H. An Alpha-Catulin Homologue Controls Neuromuscular Function through Localization of the Dystrophin Complex and BK Channels in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 6 (8), 1-13 (2010).
- Gourgou, E., Chronis, N. Chemically induced oxidative stress affects ASH neuronal function and behavior in C. elegans. Scientific Reports. 6, 1-9 (2016).
- Zahratka, J. A., Williams, P. D. E., Summers, P. J., Komuniecki, R. W., Bamber, B. A. Serotonin differentially modulates Ca2+ transients and depolarization in a C. elegans nociceptor. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1041-1050 (2015).
- Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26 (3), 583-594 (2000).
- Nekimken, A. L., et al. Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap. Lab Chip. 17 (6), 1116-1127 (2017).
- Chung, S. H., Sun, L., Gabel, C. V. In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (74), 1-9 (2013).
- Jospin, M., Jacquemond, V., Mariol, M. C., Ségalat, L., Allard, B. The L-type voltage-dependent Ca2+channel EGL-19 controls body wall muscle function in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 159 (2), 337-347 (2002).
- Wabnig, S., Liewald, J. F., Yu, S., Gottschalk, A. High-Throughput All-Optical Analysis of Synaptic Transmission and Synaptic Vesicle Recycling in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. , 1-26 (2015).
