C. 예쁜꼬마선충의 생체내 칼슘 이미징
Summary
이 방법은 모델 유기체 C. elegans의신체 벽 근육에서 발동 된 칼슘 과도 의 변화와 이미지 기준선 세포질 칼슘 수준에 광유전학 및 유전적으로 코딩 된 칼슘 센서를 결합하는 방법을 제공합니다.
Abstract
모델 유기체 C. 예쁜꼬마선충은 생체 내 칼슘 이미징을 수행하는 우수한 시스템을 제공한다. 그것의 투명한 바디 및 유전 적 변형성은 유전으로 인코딩된 칼슘 센서의 표적으로 한 표현을 허용합니다. 이 프로토콜은 표적 세포, 특히 벌레의 신체 벽 근육에서 칼슘 역학의 생체 내 이미징을 위해 이러한 센서의 사용을 설명합니다. 시냅스 전 채널로도셉신의 공동 발현을 활용함으로써, 흥분성 운동 뉴런으로부터 아세틸콜린 방출의 자극은 청색광 펄스를 사용하여 유도될 수 있으며, 그 결과 근육 탈분극및 세포질 칼슘의 재현 가능한 변화 수준. 두 가지 웜 고정 기술은 다양한 난이도에 대해 논의합니다. 이러한 기술의 비교는 두 접근법모두 신경 근육 접합의 생리학을 보존하고 칼슘 과도의 재현 가능한 정량화를 허용한다는 것을 보여줍니다. 광유전학과 기능성 칼슘 이미징을 페어링함으로써, 후성 칼슘 취급 및 항상성의 변화는 다양한 돌연변이 배경에서 평가될 수 있다. 제시된 데이터는 고정 화 기술을 모두 검증하고 특히 C. elegans 사르코 (endo)플라스성 망상 칼슘 ATPase 및 신체 벽 근육 칼슘 조절에서 칼슘 활성화 BK 칼륨 채널의 역할을 검사합니다.
Introduction
이 논문은 광유전적 신경 자극을 사용하여 C. elegans 신체 벽 근육의 생체 내 칼슘 이미징 방법을 제시합니다. 유전적으로 발현된 근육과 청색광이 발동된 신경탈분극을 결합하고 자극된 후발성 칼슘 과도를 명확하게 관찰하는 시스템을 제공한다. 이것은 전기 자극의 사용을 피하고, 후나해 칼슘 역학에 영향을 미치는 돌연변이의 비침습적 분석을 허용합니다.
GCaMP와 같은 단일 형광포골 GECIs는 C-말단에서 의 N 말단 및 칼모둘린(CaM)에서 미오신 경변 키나아제의 M13 도메인에 융합된 단일 형광 단백질 분자를 사용합니다. 칼슘 결합시, 칼슘에 대한 높은 친화력을 가지는 CaM 도메인은 형광 강도 의 증가로 이어지는 형광 단백질의 후속 형태 변화를 유도하는 형태 변화를 겪습니다1. GCaMP 형광은 488 nm에서 흥분하여 473 nm의 유사한 여기 파장을 가진 채널로도셉신과 함께 사용하는 것이 부적절합니다. 따라서, 채널로도신 자극과 칼슘 측정을 결합하기 위해서는 GCaMP의 녹색 형광 단백질을 적색 형광 단백질, mRuby(RCaMP)로 대체할 필요가 있다. 채널로도프신의 해 운동 뉴런 발현과 함께, 표현된 근육 RCaMP를 사용하여, 동일한 동물 내의 광유전학 및 기능적 이미징을 동시에 사용하는 웜 신경 근육 접합부(NMJ)에서의 연구를 허용합니다. 2.
channelrhodopsin의 사용은 C. elegans의신경 근육 접합을 탈분극하기 위하여 전기 자극을 위한 필요를 우회합니다, 따라서 이 기술을 채택하기 쉽고 더 정밀하게 만드는 해부한 준비에서만 달성될 수 있습니다 특정 조직을 대상으로 할 때. 예를 들어, channelrhodopsin는 이전에 C. 예쁜꼬마선충에서 특정 뉴런을 가역적으로 활성화시키는 데 사용되어 왔으며, 흥분제 또는 억제 뉴런의 강력한 활성화로 이어지며3,4. 빛 자극 된 탈분극의 사용은 또한 직접적인 전기 자극으로 인한 신경 손상의 문제를 우회합니다. 이것은 후성 칼슘 역학에 지속적이고 반복적인 자극을 포함하여 많은 다른 자극 프로토콜의 효력을 검토할 기회를 제공합니다4.
C. elegans의 투명한 성질은 형광 화상 진찰 기능 분석을 위해 이상적이습니다. 그러나, NMJ에서 흥분성의 아세틸 콜린 뉴런을 자극 할 때, 동물은 즉각적인 근육 수축으로 반응 할 것으로 예상된다4,이산 칼슘 변화를 시각화에 중요한 벌레의 고정을 만들기. 전통적으로, 약리학 에이전트는 동물을 마비하는 데 사용되어 왔다. 이러한 약물 중 하나는 레바미솔, 해 아세틸 콜린 수용체 작용제5,6,7. 레바미솔은 흥분성 근육 수용체의 아류형의 지속적인 활성화를 유도하기 때문에,이 시약은 근육 칼슘 역학의 연구에 적합하지 않습니다. levamisole의 작용은 세포질 칼슘을 상승시키고, 시냅스 전 자극 에 따른 관찰을 폐색, 후발성 탈분극을 유도합니다. 마비 약물의 사용을 피하기 위해, 우리는 C. 예쁜 꼬마를고정하는 두 가지 대체 방법을 검사했습니다. 동물은 접착한 다음 해부하여 체벽 근육을 노출시켰으며, 기존의 C. elegans NMJ 전기생리학 방법8,또는 나노비드는 손상되지 않은 동물을 고정시키기 위해 사용하였다9. 두 절차 모두 쉽게 정량화 할 수 있었다 휴식과 연상 근육 칼슘 과도의 재현 측정을 허용했다.
이 논문의 방법은 C. elegans의후층 성 신체 벽 근육 세포에서 기준선 세포질 칼슘 수준 과도를 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 두 가지 서로 다른 고정 기술을 사용하는 데이터의 예가 제공됩니다. 두 기술은 전기 자극을 사용하지 않고 근육 세포를 탈분극하기 위해 광유전학을 활용합니다. 이 예는 벌레에 있는 후발성 칼슘 취급에 영향을 미치는 돌연변이를 평가하고 2개의 고정화 접근의 장단점을 지적하는 이 방법의 타당성을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
GEC는 C. elegans 신경생물학에 있는 강력한 공구입니다. 이전 연구는 다양한 자극 방법으로 감각 및 행동 반응을 포함한 뉴런과 근육 세포 모두에서 다양한 기능을 검사하기 위해 칼슘 이미징 기술을 활용했습니다. 일부 연구는 감각 ASH뉴런22,23에서 칼슘 과도를 유발하거나 인두 근육에서 칼슘 파를 유도하기 위해 화학 자극을 사용했다<sup class="xref"…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 ZX1659에 대한 박사 알렉산더 고트샬크, RCaMP 및 웜 균주를 포함하는 channelrhodopsin, 슬로-1 (eg142) 웜 균주에 대한 김홍균 박사, 그리고 sca-1 (tm5339) 웜 균주에 대한 국가 생물 자원 프로젝트에 감사드립니다.
Materials
| all-trans retinal | Sigma-Aldrich | R2500 | Necessary for excitation of channel rhodopsin |
| Amber LED | RCaMP illumination | ||
| Arduino UNO | Mouser | 782-A000066 | Controls fluorescence illumination |
| Blue LED | channelrhodopsin illumination | ||
| BX51WI microscope | Olympus | Fixed state compound microscope | |
| Current controlled low noise linear power supply | Ametek | Sorenson | Controls LED intensity |
| Igor Pro | Wavemetrics | Wavemetrics.com | Graphing software |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov | Image processing software |
| LUMFLN 60x water NA 1.4 | Olympus | Water immersion objective for dissected preparation | |
| Master-8 Stimulator | A.M.P.I | Master timer for image acquisition and LED illumination | |
| Micro-Manager | micro-manager.org | Controls camera acquisition and LED excitiation | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
| pco.edge 4.2 CMOS camera | pco. | 4.2 | High-speed camera |
| PlanApo N 60x oil NA 1.4 | Olympus | Oil immersion objective for nanobead preparation | |
| Polybead microspheres | Polysciences, Inc. | 00876-15 | For worm immobilization |
| solid state switches | Sensata Technologies | Crydom CMX100D6 | Controls timing of LED illumination |
| Transgenic strain, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | SY1627 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with SERCA mutant allele |
| Transgenic strain, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with calcium-activated BK potassium channel mutant allele | |
| Transgeneic strain, [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Gottschalk Lab | ZX1659 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line |
References
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 1-29 (2013).
- Nagel, G., et al. Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses. Current Biology. 15 (24), 2279-2284 (2005).
- Liewald, J. F., et al. Optogenetic analysis of synaptic function. Nature Methods. 5 (10), 895-902 (2008).
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. Laser Microsurgery in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biology. 107, 177-206 (2012).
- Lewis, J. A., et al. Cholinergic Receptor Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 7 (10), 3059-3071 (1987).
- Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 95 (4), 905-928 (1980).
- Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature Neuroscience. 9, 791-798 (1999).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-Term Imaging of Caenorhabditis elegans Using Nanoparticle-Mediated Immobilization. PLoS ONE. 8 (1), 1-6 (2013).
- Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using umanager. Current Protocols in Molecular Biology. (Suppl 92), 1-17 (2010).
- Richmond, J. Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction. Journal of Visualized Experiments. (24), 1-4 (2009).
- Hoon Cho, J., Bandyopadhyay, J., Lee, J., Park, C. S., Ahnn, J. Two isoforms of sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) are essential in Caenorhabditis elegans. Gene. 261, 211-219 (2000).
- Zwaal, R. R., et al. The Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+ ATPase Is Required for Development and Muscle Function in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 276 (47), 43557-43563 (2001).
- Stammers, A. N., et al. The regulation of sarco(endo)plasmic reticulum calcium-ATPases (SERCA). Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 93, 1-12 (2015).
- Clapham, D. E. Calcium Signaling. Cell. 131, 1047-1058 (2007).
- Hovnanian, A. Serca pumps and human diseases. Calcium Signalling and Disease: Molecular Pathology of Calcium. , 337-363 (2007).
- Periasamy, M., Kalyanasundaram, A. SERCA pump isoforms: Their role in calcium transport and disease. Muscle and Nerve. 35 (4), 430-442 (2007).
- Gehlert, S., Bloch, W., Suhr, F. Ca2+-Dependent Regulations and Signaling in Skeletal Muscle: From Electro-Mechanical Coupling to Adaptation. International Journal of Molecular Sciences. 16, 1066-1095 (2015).
- Martin, A. A., Richmond, J. E. The sarco(endo)plasmic reticulum calcium ATPase SCA-1 regulates the Caenorhabditis elegans nicotinic acetylcholine receptor ACR-16. Cell Calcium. 72, 104-115 (2018).
- Wang, Z., Saifee, O., Nonet, M. L., Salkoff, L. SLO-1 Potassium Channels Control Quantal Content of Neurotransmitter Release at the C. elegans Neuromuscular Junction. Neuron. 32, 867-881 (2001).
- Abraham, L. S., Oh, H. J., Sancar, F., Richmond, J. E., Kim, H. An Alpha-Catulin Homologue Controls Neuromuscular Function through Localization of the Dystrophin Complex and BK Channels in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 6 (8), 1-13 (2010).
- Gourgou, E., Chronis, N. Chemically induced oxidative stress affects ASH neuronal function and behavior in C. elegans. Scientific Reports. 6, 1-9 (2016).
- Zahratka, J. A., Williams, P. D. E., Summers, P. J., Komuniecki, R. W., Bamber, B. A. Serotonin differentially modulates Ca2+ transients and depolarization in a C. elegans nociceptor. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1041-1050 (2015).
- Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26 (3), 583-594 (2000).
- Nekimken, A. L., et al. Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap. Lab Chip. 17 (6), 1116-1127 (2017).
- Chung, S. H., Sun, L., Gabel, C. V. In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (74), 1-9 (2013).
- Jospin, M., Jacquemond, V., Mariol, M. C., Ségalat, L., Allard, B. The L-type voltage-dependent Ca2+channel EGL-19 controls body wall muscle function in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 159 (2), 337-347 (2002).
- Wabnig, S., Liewald, J. F., Yu, S., Gottschalk, A. High-Throughput All-Optical Analysis of Synaptic Transmission and Synaptic Vesicle Recycling in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. , 1-26 (2015).
