C.エレガンス体壁筋肉における生体内カルシウムイメージング
Summary
この方法は、光遺伝学と遺伝的にコード化されたカルシウムセンサーを画像ベースラインサイトソリックカルシウムレベルおよびモデル生物C.エレガンスの体壁筋肉における誘発カルシウム過渡の変化に組み合わせる方法を提供する。
Abstract
モデル生物C.エレガンスは、生体内カルシウムイメージングを行うための優れたシステムを提供します。その透明なボディおよび遺伝的な操作性は遺伝的にコードされたカルシウムセンサーの標的化された発現を可能にする。このプロトコルは、標的細胞におけるカルシウムダイナミクス、特にワームの体壁筋の生体内イメージングに対するこれらのセンサの使用を概説する。シナプス前チャネルロドプシンの共発現を利用することにより、興奮性運動ニューロンからのアセチルコリン放出の刺激は、青色光パルスを用いて誘導され、細胞質カルシウムの筋肉脱分極および再現性の変化をもたらすレベル。2 つのワーム固定化手法は、さまざまなレベルの難易度で説明されています。これらの技術の比較は、両方のアプローチが神経筋接合部の生理学を維持し、カルシウム過渡の再現可能な定量を可能にすることを示しています。光遺伝学と機能性カルシウムイメージングを組み合わせることで、後代カルシウム取り扱いと恒常性の変化を様々な変異型の背景で評価することができます。提示されたデータは、固定化技術の両方を検証し、具体的には、C.エレガンスサルコ(endo)プラスミック網状カルシウムATPaseと体壁筋カルシウム調節におけるカルシウム活性化BKカリウムチャネルの役割を調べます。
Introduction
本論文では,光遺伝学的神経刺激を用いたC.エレガンス体壁筋の生体内カルシウムイメージングの方法を紹介する.遺伝的にコードされたカルシウム指標(GECI)を青色光で発現した筋肉を組み合わせ、神経脱分極を引き起こし、誘発されたシナプスカルシウム過渡を明確に観察するシステムを提供する。これは電気刺激の使用を避け、後のカルシウムダイナミクスに影響を与える変異体の非侵襲的な分析を可能にする。
GCaMPのような単一蛍光性GECは、そのN末端端部でミオシン軽鎖キナーゼのM13ドメインに融合した単一の蛍光タンパク質分子を使用し、C末端ではカルモジュリン(CaM)を使用する。カルシウム結合時に、カルシウムに対して高い親和性を有するCaMドメインは、蛍光強度1の増加につながる蛍光タンパク質のその後の立体構造変化を誘発する立体構造変化を受ける。GCaMP蛍光は488nmで励起され、473nmの同様の励起波長を有するチャネルロドプシンと組み合わせて使用することは不適当である。したがって、カルシウム測定値とチャネロドプシン刺激を組み合わせるには、GCaMPの緑色蛍光タンパク質を赤色蛍光タンパク質mRuby(RCaMP)に置き換える必要があります。RCaMPを発現した筋肉を用いて、チャネルロドプシンのコリン作動性運動ニューロン発現と組み合わせて、同じ動物内で光遺伝学と機能イメージングを同時に使用するワーム神経筋接合部(NMJ)での研究を可能にする2.
チャネルロドプシンの使用は、C.エレガンスの神経筋接合部を脱分極するための電気刺激の必要性をバイパスし、解剖製剤でのみ達成できるため、この技術を使用しやすく、より正確に行うことができる。特定の組織を標的にする場合。例えば、チャネルロドプシンは、以前にC.エレガンスで特定のニューロンを可逆的に活性化するために使用され、興奮性または阻害性ニューロン3、4の堅牢な活性化のいずれかにつながる。光刺激脱分極の使用はまた、直接電気刺激による神経損傷の問題を回避する。これは、持続および繰り返し刺激を含む多くの異なる刺激プロトコルが、経例カルシウムダイナミクス4に及ぼす影響を調べる機会を提供する。
C.エレガンスの透明な性質は蛍光イメージング機能分析にとって理想的である。しかし、NMJで興奮性アセチルコリンニューロンを刺激する場合、動物は即時の筋肉収縮4で応答することが期待され、離散的なカルシウム変化を視覚化する上でワームの固定化が重要である。伝統的に、薬理学的薬剤は、動物を麻痺させるために使用されてきました。使用されるそのような薬物の1つは、レバミソール、コリン作動性アセチルコリン受容体アゴニスト5、6、7である。レバミソールは興奮性筋受容体のサブタイプの持続的な活性化につながるので、この試薬は筋肉カルシウムダイナミクスの研究には不向きである。レバミソールの作用は、シナプス後脱分極、細胞体カルシウムの上昇、およびシナプス前刺激後の観察を遮断する。麻痺薬の使用を避けるために、我々はC.エレガンスを固定する2つの代替方法を検討した。動物を接着し、次いで体壁の筋肉を露出させるために開いて解剖した動物は、既存のC.エレガンスNMJ電気生理学法8と同様に、またはナノビーズを無傷の動物9を固定するために使用した。両方の手順は、安静時の再現可能な測定を可能にし、容易に定量化可能な筋肉カルシウム過渡を誘発した。
この論文の方法は、C.エレガンスにおける後体壁筋細胞における基サイトソー酸カルシウムレベルおよび過渡性のベースラインを測定するために使用することができる。2つの異なる固定化技術を用いたデータの例が示される。両方の技術は、電気刺激を使用せずに筋肉細胞を脱分極するために光遺伝学を利用します。これらの例は、ワームにおける後質カルシウム処理に影響を与える変異を評価する際にこの方法の実現可能性を示し、2つの固定化アプローチの長所と短所を指摘する。
Protocol
Representative Results
Discussion
GECはC.エレガンス神経生物学の強力なツールです。これまでの研究では、カルシウムイメージング技術を用いて、感覚反応や行動反応など、ニューロンと筋肉細胞の両方で多種多様な機能を調べ、様々な刺激方法を用いた。いくつかの研究は、感覚ASHニューロン22、23、または咽頭筋肉24でカルシウム波を誘導するために化学…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、ZX1659のアレクサンダー・ゴッチョルク博士、ワーム株を含むRCaMPとチャネルロドプシン、slo-1(例えば142)ワーム株のホンギョン・キム博士、およびsca-1(tm5339)ワーム株の国家生物資源プロジェクトに感謝しています。
Materials
| all-trans retinal | Sigma-Aldrich | R2500 | Necessary for excitation of channel rhodopsin |
| Amber LED | RCaMP illumination | ||
| Arduino UNO | Mouser | 782-A000066 | Controls fluorescence illumination |
| Blue LED | channelrhodopsin illumination | ||
| BX51WI microscope | Olympus | Fixed state compound microscope | |
| Current controlled low noise linear power supply | Ametek | Sorenson | Controls LED intensity |
| Igor Pro | Wavemetrics | Wavemetrics.com | Graphing software |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov | Image processing software |
| LUMFLN 60x water NA 1.4 | Olympus | Water immersion objective for dissected preparation | |
| Master-8 Stimulator | A.M.P.I | Master timer for image acquisition and LED illumination | |
| Micro-Manager | micro-manager.org | Controls camera acquisition and LED excitiation | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
| pco.edge 4.2 CMOS camera | pco. | 4.2 | High-speed camera |
| PlanApo N 60x oil NA 1.4 | Olympus | Oil immersion objective for nanobead preparation | |
| Polybead microspheres | Polysciences, Inc. | 00876-15 | For worm immobilization |
| solid state switches | Sensata Technologies | Crydom CMX100D6 | Controls timing of LED illumination |
| Transgenic strain, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | SY1627 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with SERCA mutant allele |
| Transgenic strain, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with calcium-activated BK potassium channel mutant allele | |
| Transgeneic strain, [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Gottschalk Lab | ZX1659 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line |
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