In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles In Vivo
Summary
Cette méthode fournit un moyen de coupler l’optogénétique et les capteurs de calcium génétiquement codés pour imager les niveaux cytosoliques de base de calcium et les changements dans les transitoires évoquées de calcium dans les muscles de la paroi du corps de l’organisme modèle C. elegans.
Abstract
L’organisme modèle C. elegans fournit un excellent système pour effectuer l’imagerie in vivo du calcium. Son corps transparent et sa manipulabilité génétique permettent l’expression ciblée de capteurs de calcium génétiquement codés. Ce protocole décrit l’utilisation de ces capteurs pour l’imagerie in vivo de la dynamique calcique dans les cellules ciblées, en particulier les muscles de la paroi du corps des vers. En utilisant la co-expression de la nérhodopsine presynaptique, la stimulation de la libération d’acétylcholine des neurones moteurs excitatifs peut être induite à l’aide d’impulsions de lumière bleue, ce qui entraîne une dépolarisation musculaire et des changements reproductibles dans le calcium cytoplasmique Niveaux. Deux techniques d’immobilisation de ver sont discutées avec des niveaux variables de difficulté. La comparaison de ces techniques démontre que les deux approches préservent la physiologie de la jonction neuromusculaire et permettent la quantification reproductible des transitoires de calcium. En jumelant l’optogénétique et l’imagerie fonctionnelle du calcium, les changements dans la manipulation du calcium postsynaptique et l’homéostasie peuvent être évalués dans une variété de milieux mutants. Les données présentées valident les deux techniques d’immobilisation et examinent spécifiquement les rôles du Sarco sarco (endo)plasmique de calcium ATPase de C. elegans et du canal de potassium DE BK calcium-activé dans la régulation de calcium de muscle de corps.
Introduction
Cet article présente des méthodes pour l’imagerie in vivo de calcium des muscles de la paroi du corps de C. elegans utilisant la stimulation neuronale optogénétique. Associer un muscle exprimé génétiquement encodé indicateur de calcium (GECI) avec la lumière bleue déclenché dépolarisation neuronale et fournit un système pour observer clairement les transitoires de calcium postsynaptic évoqués. Cela évite l’utilisation de la stimulation électrique, permettant une analyse non invasive des mutants affectant la dynamique du calcium postsynaptique.
Les GECI à fluorophore unique, comme le GCaMP, utilisent une seule molécule de protéine fluorescente fusionnée au domaine M13 de la kinase de la chaîne lumineuse de myosine à son extrémité N-terminale et de la calmoduline (CaM) au terminus C. Lors de la liaison calcique, le domaine CaM, qui a une forte affinité pour le calcium, subit un changement conformationnel induisant un changement conformationnel ultérieur dans la protéine fluorescente conduisant à une augmentation de l’intensité de fluorescence1. La fluorescence GCaMP est excitée à 488 nm, ce qui le rend impropre à être utilisé en conjonction avec la canalrhodopsine, qui a une longueur d’onde d’excitation similaire de 473 nm. Ainsi, afin de coupler les mesures de calcium avec la stimulation de canalrhodopsine, la protéine fluorescente verte de GCaMP doit être remplacée par une protéine fluorescente rouge, mRuby (RCaMP). L’utilisation du muscle exprimé RCaMP, en combinaison avec l’expression cholinergique de neurone moteur de la canalrhodopsine, permet des études à la jonction neuromusculaire de ver (NMJ) avec l’utilisation simultanée de l’optogénétique et de l’imagerie fonctionnelle dans le même animal 2.
L’utilisation de la canalrhodopsine contourne la nécessité de la stimulation électrique pour dépolariser les jonctions neuromusculaires de C. elegans, qui ne peuvent être réalisées que dans les préparations disséquées, rendant ainsi cette technique à la fois plus facile à utiliser et plus précise en ciblant des tissus spécifiques. Par exemple, channelrhodopsin a été précédemment utilisé dans C. elegans pour activer de façon réversible des neurones spécifiques, conduisant à l’activation robuste des neurones excitateurs ou inhibiteurs3,4. L’utilisation de la dépolarisation stimulée par la lumière contourne également la question des dommages neuronaux dus à la stimulation électrique directe. Ceci fournit l’occasion d’examiner les effets de beaucoup de différents protocoles de stimulation, y compris les stimulations soutenues et répétées, sur la dynamique de calcium postsynaptic4.
La nature transparente de C. elegans le rend idéal pour l’analyse fonctionnelle de l’imagerie fluorescente. Cependant, en stimulant les neurones excitatifs d’acétylcholine au NMJ, les animaux sont censés répondre avec une contraction musculaire immédiate4,rendant l’immobilisation des vers critique en visualisant les changements discrets de calcium. Traditionnellement, les agents pharmacologiques ont été utilisés pour paralyser les animaux. Un tel médicament utilisé est le lévamisole, un agoniste récepteur de l’acétolcholine cholinergique5,6,7. Puisque le lévamisole conduit à l’activation persistante d’un sous-type de récepteurs musculaires excitatifs, ce réactif est impropre à l’étude de la dynamique du calcium musculaire. L’action du lévamisole induit la dépolarisation postsynaptique, élevant le calcium cytosolique, et occluding observations suivant la stimulation presynaptic. Pour éviter l’utilisation de médicaments paralysants, nous avons examiné deux méthodes alternatives pour immobiliser C. elegans. Les animaux ont été collés vers le bas et puis disséqués ouverts pour exposer les muscles de la paroi du corps, semblable à la méthode d’électrophysiologie C. elegans NMJ8, ou nanobeads ont été utilisés pour immobiliser les animaux intacts9. Les deux procédures ont permis les mesures reproductibles du repos et ont évoqué des transitoires de calcium de muscle qui étaient facilement quantifiables.
Les méthodes dans cet article peuvent être employées pour mesurer les niveaux cytosoliques de base de calcium et les transitoires dans les cellules de muscle de corps postsynaptic dans C. elegans. Des exemples de données utilisant les deux techniques d’immobilisation différentes sont donnés. Les deux techniques tirent parti de l’optogénétique pour dépolariser les cellules musculaires sans l’utilisation de stimulation électrique. Ces exemples démontrent la faisabilité de cette méthode dans l’évaluation des mutations qui affectent la manipulation du calcium postsynaptique dans les vers et soulignent les avantages et les inconvénients des deux approches d’immobilisation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les GECI sont un outil puissant en neurobiologie de C. elegans. Des travaux antérieurs ont utilisé des techniques d’imagerie calcique pour examiner une grande variété de fonctions dans les neurones et les cellules musculaires, y compris les réponses sensorielles et comportementales, avec des méthodes variées de stimulation. Certaines études ont utilisé des stimuli chimiques pour déclencher les transitoires de calcium dans les neurones sensoriels ASH22,<sup class="xref…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient le Dr Alexander Gottschalk pour ZX1659, le RCaMP et la channelrhodopsine contenant la souche de ver, le Dr Hongkyun Kim pour la souche de ver slo-1(eg142), et le National Bioresource Project pour la souche de ver sca-1(tm5339).
Materials
| all-trans retinal | Sigma-Aldrich | R2500 | Necessary for excitation of channel rhodopsin |
| Amber LED | RCaMP illumination | ||
| Arduino UNO | Mouser | 782-A000066 | Controls fluorescence illumination |
| Blue LED | channelrhodopsin illumination | ||
| BX51WI microscope | Olympus | Fixed state compound microscope | |
| Current controlled low noise linear power supply | Ametek | Sorenson | Controls LED intensity |
| Igor Pro | Wavemetrics | Wavemetrics.com | Graphing software |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov | Image processing software |
| LUMFLN 60x water NA 1.4 | Olympus | Water immersion objective for dissected preparation | |
| Master-8 Stimulator | A.M.P.I | Master timer for image acquisition and LED illumination | |
| Micro-Manager | micro-manager.org | Controls camera acquisition and LED excitiation | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
| pco.edge 4.2 CMOS camera | pco. | 4.2 | High-speed camera |
| PlanApo N 60x oil NA 1.4 | Olympus | Oil immersion objective for nanobead preparation | |
| Polybead microspheres | Polysciences, Inc. | 00876-15 | For worm immobilization |
| solid state switches | Sensata Technologies | Crydom CMX100D6 | Controls timing of LED illumination |
| Transgenic strain, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | SY1627 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with SERCA mutant allele |
| Transgenic strain, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with calcium-activated BK potassium channel mutant allele | |
| Transgeneic strain, [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Gottschalk Lab | ZX1659 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line |
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