सी elegans शरीर की दीवार की मांसपेशियों में Vivo कैल्शियम इमेजिंग में
Summary
इस विधि से दो ऑप्टोजेनेटिक्स और आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम सेंसरों को छवि आधारभूत साइटोसोलिक कैल्शियम के स्तर और मॉडल जीव सी एलिगेंसके शरीर की दीवार की मांसपेशियों में कैल्शियम यात्रियों में परिवर्तन करने का एक तरीका मिलता है .
Abstract
मॉडल जीव सी elegans विवो कैल्शियम इमेजिंग में प्रदर्शन करने के लिए एक उत्कृष्ट प्रणाली प्रदान करता है। इसके पारदर्शी शरीर और आनुवंशिक manipulability आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम सेंसर के लक्षित अभिव्यक्ति के लिए अनुमति देते हैं. इस प्रोटोकॉल लक्षित कोशिकाओं में कैल्शियम गतिशीलता के in vivo इमेजिंग के लिए इन सेंसरों के उपयोग की रूपरेखा, विशेष रूप से कीड़े के शरीर की दीवार की मांसपेशियों. presynaptic channelrhodopsin के सह-अभिव्यक्ति का उपयोग करके, उत्तेजक मोटर न्यूरॉन्स से acetylcholine रिलीज की उत्तेजना नीले प्रकाश दालों का उपयोग कर प्रेरित किया जा सकता है, मांसपेशियों depolarization और कोशिकाद्रव्यी कैल्शियम में reproducible परिवर्तन में जिसके परिणामस्वरूप स्तर. दो कृमि स्थिरीकरण तकनीकों की चर्चा कठिनाई के विभिन्न स्तरों के साथ की जाती है। इन तकनीकों की तुलना दर्शाता है कि दोनों दृष्टिकोण neuromuscular जंक्शन के शरीर क्रिया विज्ञान की रक्षा और कैल्शियम यात्रियों के reproduible परिमाणीकरण के लिए अनुमति देते हैं. optogenetics और कार्यात्मक कैल्शियम इमेजिंग बाँधना द्वारा, postsynaptic कैल्शियम हैंडलिंग और homeostasis में परिवर्तन उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि की एक किस्म में मूल्यांकन किया जा सकता है. प्रस्तुत डेटा दोनों स्थिरीकरण तकनीकों की पुष्टि करता है और विशेष रूप से सी elegans सार्को (एंडो) की भूमिकाओं की जांच करता है-प्लासी रेटिकल कैल्शियम ATPase और शरीर की दीवार मांसपेशी कैल्शियम विनियमन में कैल्शियम सक्रिय बी के पोटेशियम चैनल।
Introduction
यह पेपर ऑप्टोजेनेटिक न्यूरोनल उत्तेजना का उपयोग करके सी एलिगन ्स्स ्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स्स एक मांसपेशी व्यक्त आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम सूचक (जीसीआई) नीले प्रकाश के साथ तंत्रिका depolarization ट्रिगर और स्पष्ट रूप से पैदा पदों का निरीक्षण करने के लिए एक प्रणाली प्रदान करता है कैल्शियम क्षणिक. यह विद्युत उत्तेजना के उपयोग से बचा जाता है, पदों को प्रभावित करने वाले म्यूटेंट के एक गैर इनवेसिव विश्लेषण की अनुमति देता है।
जीकेएमपी जैसे सिंगल-फ्लोरोफोर जीईसी, सी-टर्मिनस में मायोसिन लाइट चेन काइनेज के एम 13 डोमेन से जुड़े एकल फ्लोरोसेंट प्रोटीन अणु का उपयोग करता है। कैल्शियम बाइंडिंग पर, केईएम डोमेन, जिसमें कैल्शियम के लिए उच्च आत्मीयता होती है, एक अनुरूपता परिवर्तन से गुजरता है जो फ्लोरोसेंट प्रोटीन में बाद में अनुरूप परिवर्तन को प्रेरित करता है जिससे फ्लोरोसेंट तीव्रता1में वृद्धि होती है। GCAMP फ्लोरोसेंट 488 एनएम पर उत्साहित है, यह channelrhodopsin, जो 473 एनएम की एक समान उत्तेजना तरंगदैर्ध्य है के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा करने के लिए अनुपयुक्त बना रही है. इस प्रकार, चैनलहोडोप्सिन उत्तेजना के साथ कुछ कैल्शियम माप के लिए, जीकेएमपी के हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन को लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन, एमRuby (RCaMP) के साथ प्रतिस्थापित करने की आवश्यकता है। मांसपेशियों को व्यक्त RCAMP का उपयोग करना, channelrhodopsin के कोलीनर्जिक मोटर न्यूरॉन अभिव्यक्ति के साथ संयोजन में, एक ही जानवर के भीतर optogenetics और कार्यात्मक इमेजिंग के एक साथ उपयोग के साथ कीड़ा neuromuscular जंक्शन (NMJ) पर अध्ययन की अनुमति देता है 2.
चैनलहोडोप्सिन का उपयोग सी एलिगनके न्यूरोमस्क्युलर जंक्शनों को अस्थिर करने के लिए विद्युत उत्तेजना की आवश्यकता को नजरअंदाज करता है, जो केवल विच्छेदन की तैयारी में प्राप्त किया जा सकता है, इस प्रकार इस तकनीक को रोजगार के लिए आसान और अधिक सटीक दोनों बनाता है जब विशिष्ट ऊतकों को लक्षित. उदाहरण के लिए, channelrhodopsin पहले सी elegans में इस्तेमाल किया गया है reversibly विशिष्ट न्यूरॉन्स को सक्रिय करने के लिए, उत्तेजक या निरोधात्मक न्यूरॉन्स के या तो मजबूत सक्रियण के लिए अग्रणी3,4. प्रकाश-उत्तेजित depolarization का उपयोग भी प्रत्यक्ष विद्युत उत्तेजना के कारण न्यूरॉन क्षति के मुद्दे को दरकिनार. यह कई अलग अलग उत्तेजना प्रोटोकॉल के प्रभाव की जांच करने का अवसर प्रदान करता है, निरंतर और दोहराया उत्तेजना सहित, postsynaptic कैल्शियम गतिशीलता4पर.
सी elegans की पारदर्शी प्रकृति यह फ्लोरोसेंट इमेजिंग कार्यात्मक विश्लेषण के लिए आदर्श बनाता है. हालांकि, जब NMJ पर उत्तेजक acetylcholine न्यूरॉन्स उत्तेजक, जानवरों के लिए एक तत्काल मांसपेशियों में संकुचन के साथ प्रतिक्रिया की उम्मीद कर रहे हैं4, असतत कैल्शियम परिवर्तन visualizing में महत्वपूर्ण कीड़े की immobilization बनाने. परंपरागत रूप से, औषधीय एजेंटों जानवरों को लकवा मार करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। ऐसी ही एक दवा का इस्तेमाल किया जाता है लेविमिसोल , एक कोलीनर्जिक एसीटाइलकोलिन रिसेप्टर एगोनिस्ट5,6,7. चूंकि levamisole उत्तेजक मांसपेशी रिसेप्टर्स के एक उपप्रकार के लगातार सक्रियण की ओर जाता है, इस अभिकर्मक मांसपेशियों कैल्शियम गतिशीलता के अध्ययन के लिए अनुपयुक्त है. लेवैमिसोल की क्रिया पोस्टिनैप्टिक विध्रुवण को प्रेरित करती है, साइटोसोलिक कैल्शियम को ऊपर उठाती है, और presynaptic उत्तेजना के बाद अवलोकन ों को रोक देती है। लकवाग्रस्त दवाओं के उपयोग से बचने के लिए, हमने सी एलिगनको स्थिर करने के लिए दो वैकल्पिक तरीकों की जांच की। जानवरों को या तो चिपका दिया गया था और फिर शरीर की दीवार की मांसपेशियों को उजागर करने के लिए खुला विच्छेदन किया गया था, मौजूदा सी एलिगन NMJ इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी विधि8के समान , या नैनोबीड का उपयोग बरकरार जानवरों को स्थिर करने के लिए किया गयाथा 9. दोनों प्रक्रियाओं आराम के reproduible माप के लिए अनुमति दी और मांसपेशियों कैल्शियम यात्रियों कि आसानी से परिमाणात्मक थे पैदा की.
इस कागज में तरीकों का उपयोग बेसलाइन साइटोसोलिक कैल्शियम के स्तर को मापने के लिए किया जा सकता है और सी एलिगन्समें पोस्टिनैप्टिक शरीर की दीवार मांसपेशियों की कोशिकाओं में यात्रियों को मापने के लिए किया जा सकता है। दो अलग-अलग स्थिरीकरण तकनीकों को नियोजित करने वाले आंकड़ों के उदाहरण दिए गए हैं। दोनों तकनीकों optogenetics का लाभ लेने के लिए विद्युत उत्तेजना के उपयोग के बिना मांसपेशियों की कोशिकाओं depolarize. ये उदाहरण उत्परिवर्तनों के मूल्यांकन में इस विधि की व्यवहार्यता प्रदर्शित करते हैं जो कीड़े में पोस्टीनैप्टिक कैल्शियम हैंडलिंग को प्रभावित करते हैं और दो स्थिरीकरण दृष्टिकोणों के पेशेवरों और विपक्षों को इंगित करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
GECIs सी elegans न्यूरोबायोलॉजी में एक शक्तिशाली उपकरण हैं. पिछले काम कैल्शियम इमेजिंग तकनीक का उपयोग किया है दोनों न्यूरॉन्स और मांसपेशियों की कोशिकाओं में कार्यों की एक विस्तृत विविधता की जांच करने के ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों के लिए धन्यवाद डॉ अलेक्जेंडर Gottschalk $X1659, RCaMP और channelrhodopsin युक्त कीड़ा तनाव, डॉ Hongkyun किम के लिए स्लो-1 (eg142) कीड़ा तनाव, और sca-1 (tm5339) कीड़ा तनाव के लिए राष्ट्रीय Bioresource परियोजना.
Materials
| all-trans retinal | Sigma-Aldrich | R2500 | Necessary for excitation of channel rhodopsin |
| Amber LED | RCaMP illumination | ||
| Arduino UNO | Mouser | 782-A000066 | Controls fluorescence illumination |
| Blue LED | channelrhodopsin illumination | ||
| BX51WI microscope | Olympus | Fixed state compound microscope | |
| Current controlled low noise linear power supply | Ametek | Sorenson | Controls LED intensity |
| Igor Pro | Wavemetrics | Wavemetrics.com | Graphing software |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov | Image processing software |
| LUMFLN 60x water NA 1.4 | Olympus | Water immersion objective for dissected preparation | |
| Master-8 Stimulator | A.M.P.I | Master timer for image acquisition and LED illumination | |
| Micro-Manager | micro-manager.org | Controls camera acquisition and LED excitiation | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
| pco.edge 4.2 CMOS camera | pco. | 4.2 | High-speed camera |
| PlanApo N 60x oil NA 1.4 | Olympus | Oil immersion objective for nanobead preparation | |
| Polybead microspheres | Polysciences, Inc. | 00876-15 | For worm immobilization |
| solid state switches | Sensata Technologies | Crydom CMX100D6 | Controls timing of LED illumination |
| Transgenic strain, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | SY1627 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with SERCA mutant allele |
| Transgenic strain, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with calcium-activated BK potassium channel mutant allele | |
| Transgeneic strain, [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Gottschalk Lab | ZX1659 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line |
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