Inne vivo kalsium tenkelig inne C. elegans kropp mur muskelen
Summary
Denne metoden gir en måte å par optogenetics og genetisk kodet kalsium sensorer til bilde Baseline cytosolic kalsium nivåer og endringer i fremkalt kalsium transienter i kroppen veggen musklene i modellen organisme C. elegans.
Abstract
Modellen organisme C. elegans gir et utmerket system for å utføre in vivo kalsium bildebehandling. Den gjennomsiktige kroppen og genetiske manipulability tillater målrettede uttrykk for genetisk kodede kalsium sensorer. Denne protokollen skisserer bruken av disse sensorene for in vivo Imaging av kalsium dynamikk i målrettede celler, spesielt kroppen veggen musklene i ormer. Ved å benytte co-uttrykk for presynaptiske nerve channelrhodopsin, stimulering av acetylkolin utgivelse fra eksitatoriske motor neurons kan bli indusert ved hjelp av blått lyspulser, resulterer i muskel depolarization og reproduserbar endringer i cytoplasmatiske kalsium Nivåer. To ormen immobilisering teknikker er diskutert med varierende vanskelighetsgrad. Sammenligning av disse teknikkene viser at begge tilnærminger bevare fysiologi av nevromuskulær krysset og la for reproduserbar kvantifisering av kalsium transienter. Ved sammenkobling av optogenetics og funksjonell kalsium avbildning kan endringer i postsynaptic kalsium håndtering og homeostase evalueres i en rekke mutant bakgrunner. Data presentert validerer både immobilisering teknikker og spesielt undersøker rollene til C. elegans sarco (Endo) plasmid Retikulære kalsium ATPase og kalsium-aktivert BK kalium kanal i kroppen veggen muskel kalsium regulering.
Introduction
Dette papiret presenterer metoder for in vivo kalsium Imaging av C. elegans Body Wall musklene bruker optogenetic neuronal stimulering. Sammenkobling av en muskel uttrykt genetisk kodet kalsium indikator (GECI) med blått lys utløst neuronal depolarization og gir et system for å tydelig observere fremkalt postsynaptic kalsium transienter. Dette unngår bruk av elektrisk stimulering, slik at en ikke-invasiv analyse av mutanter påvirker postsynaptic kalsium dynamikk.
Single-fluoroforen GECIs, som GCaMP, bruker et enkelt fluorescerende protein molekyl smeltet til M13 domenet av myosin lys kjeden kinase på sin N-Terminal ende og calmodulin (CaM) på C-Terminus. Ved kalsium binding, gjennomgår CaM-domenet, som har en høy affinitet for kalsium, en conformational endring som fremkaller en påfølgende conformational endring i fluorescerende protein som fører til en økning i fluorescens intensitet1. GCaMP fluorescens er spent på 488 NM, noe som gjør det uegnet til å bli brukt i forbindelse med channelrhodopsin, som har en lignende eksitasjon bølgelengde på 473 NM. Således, for å par kalsium målinger med channelrhodopsin stimulering, det grønne fluorescerende proteinet av GCaMP må byttes ut med et rødt fluorescerende protein, mRuby (RCaMP). Bruke muskelen uttrykt RCaMP, i kombinasjon med kolinerge motoriske Nevron uttrykk for channelrhodopsin, tillater studier ved ormen nevromuskulær Junction (NMJ) med samtidig bruk av optogenetics og funksjonell Imaging innenfor samme dyr 2i det.
Bruken av channelrhodopsin omgår behovet for elektrisk stimulering for å depolarize den nevromuskulær kryss av C. elegans, som bare kan oppnås i dissekert preparater, og dermed gjør denne teknikken både enklere å ansette og mer presis Når du målretter mot spesifikke vev. For eksempel, channelrhodopsin har tidligere vært brukt i C. elegans å reverserbart aktivere spesifikke neurons, fører til enten robust aktivering av eksitatoriske eller hemmende neurons3,4. Bruken av lys-stimulert depolarization også omgår spørsmålet om neuronal Kader på grunn av direkte elektrisk stimulering. Dette gir en mulighet til å undersøke virkningene av mange ulike stimulering protokoller, inkludert vedvarende og gjentatt stimuleringer, på postsynaptic kalsium dynamikk4.
Den gjennomsiktige natur C. elegans gjør det ideelt for fluorescerende Imaging funksjonell analyse. Men når stimulere eksitatoriske acetylkolin neurons på NMJ, dyr er forventet å svare med en umiddelbar muskel sammentrekning4, noe som gjør immobilisering av ormer kritisk i visualisere diskrete kalsium endringer. Tradisjonelt har farmakologiske midler blitt brukt til å lamme dyrene. Et slikt legemiddel som brukes er levamisole, en kolinerge acetylkolin reseptor Agonistiske5,6,7. Siden levamisole fører til vedvarende aktivering av en under type av eksitatoriske muskel reseptorer, denne reagens er uegnet for studiet av muskel kalsium dynamikk. Handlingen av levamisole induserer postsynaptic depolarization, heve cytosolic kalsium, og okkluderer observasjoner etter presynaptiske nervestimulering. For å unngå bruk av lammende narkotika, undersøkte vi to alternative metoder for å nakkens C. elegans. Dyrene var enten limt ned og deretter dissekert åpne for å eksponere kroppen veggen musklene, lik den eksisterende C. elegans nmj elektrofysiologi metode8, eller nanobeads ble brukt til å nakkens intakt dyr9. Begge prosedyrene er tillatt for reproduserbar målinger av hvile og fremkalt muskel kalsium transienter som var lett målbare.
Metodene i dette papiret kan brukes til å måle Baseline cytosolic kalsium nivåer og transienter i postsynaptic kroppen veggen muskelceller i C. elegans. Eksempler på data som sysselsetter de to ulike immobilisering teknikkene er gitt. Begge teknikkene dra nytte av optogenetics å depolarize muskelceller uten bruk av elektrisk stimulering. Disse eksemplene viser muligheten for denne metoden i å evaluere mutasjoner som påvirker postsynaptic kalsium håndtering i ormer og påpeke fordeler og ulemper med de to immobilisering tilnærminger.
Protocol
Representative Results
Discussion
GECIs er et kraftig verktøy i C. elegans nevrobiologi. Tidligere arbeid har benyttet kalsium Imaging teknikker for å undersøke en rekke funksjoner i både neurons og muskelceller, inkludert sensoriske og atferdsmessige responser, med varierte metoder for stimulering. Noen studier har brukt kjemiske stimuli for å utløse kalsium transienter i Sensorisk aske neurons22,23 eller for å indusere kalsium bølger i pharyngeal muskler24</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Dr. Alexander Gottschalk for ZX1659, den RCaMP og channelrhodopsin inneholder ormen belastning, Dr. Hongkyun Kim for slo-1 (eg142) ormen belastning, og National Bioresource Project for SCA-1 (tm5339) ormen belastning.
Materials
| all-trans retinal | Sigma-Aldrich | R2500 | Necessary for excitation of channel rhodopsin |
| Amber LED | RCaMP illumination | ||
| Arduino UNO | Mouser | 782-A000066 | Controls fluorescence illumination |
| Blue LED | channelrhodopsin illumination | ||
| BX51WI microscope | Olympus | Fixed state compound microscope | |
| Current controlled low noise linear power supply | Ametek | Sorenson | Controls LED intensity |
| Igor Pro | Wavemetrics | Wavemetrics.com | Graphing software |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov | Image processing software |
| LUMFLN 60x water NA 1.4 | Olympus | Water immersion objective for dissected preparation | |
| Master-8 Stimulator | A.M.P.I | Master timer for image acquisition and LED illumination | |
| Micro-Manager | micro-manager.org | Controls camera acquisition and LED excitiation | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
| pco.edge 4.2 CMOS camera | pco. | 4.2 | High-speed camera |
| PlanApo N 60x oil NA 1.4 | Olympus | Oil immersion objective for nanobead preparation | |
| Polybead microspheres | Polysciences, Inc. | 00876-15 | For worm immobilization |
| solid state switches | Sensata Technologies | Crydom CMX100D6 | Controls timing of LED illumination |
| Transgenic strain, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | SY1627 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with SERCA mutant allele |
| Transgenic strain, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with calcium-activated BK potassium channel mutant allele | |
| Transgeneic strain, [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Gottschalk Lab | ZX1659 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line |
References
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 1-29 (2013).
- Nagel, G., et al. Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses. Current Biology. 15 (24), 2279-2284 (2005).
- Liewald, J. F., et al. Optogenetic analysis of synaptic function. Nature Methods. 5 (10), 895-902 (2008).
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. Laser Microsurgery in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biology. 107, 177-206 (2012).
- Lewis, J. A., et al. Cholinergic Receptor Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 7 (10), 3059-3071 (1987).
- Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 95 (4), 905-928 (1980).
- Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature Neuroscience. 9, 791-798 (1999).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-Term Imaging of Caenorhabditis elegans Using Nanoparticle-Mediated Immobilization. PLoS ONE. 8 (1), 1-6 (2013).
- Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using umanager. Current Protocols in Molecular Biology. (Suppl 92), 1-17 (2010).
- Richmond, J. Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction. Journal of Visualized Experiments. (24), 1-4 (2009).
- Hoon Cho, J., Bandyopadhyay, J., Lee, J., Park, C. S., Ahnn, J. Two isoforms of sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) are essential in Caenorhabditis elegans. Gene. 261, 211-219 (2000).
- Zwaal, R. R., et al. The Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+ ATPase Is Required for Development and Muscle Function in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 276 (47), 43557-43563 (2001).
- Stammers, A. N., et al. The regulation of sarco(endo)plasmic reticulum calcium-ATPases (SERCA). Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 93, 1-12 (2015).
- Clapham, D. E. Calcium Signaling. Cell. 131, 1047-1058 (2007).
- Hovnanian, A. Serca pumps and human diseases. Calcium Signalling and Disease: Molecular Pathology of Calcium. , 337-363 (2007).
- Periasamy, M., Kalyanasundaram, A. SERCA pump isoforms: Their role in calcium transport and disease. Muscle and Nerve. 35 (4), 430-442 (2007).
- Gehlert, S., Bloch, W., Suhr, F. Ca2+-Dependent Regulations and Signaling in Skeletal Muscle: From Electro-Mechanical Coupling to Adaptation. International Journal of Molecular Sciences. 16, 1066-1095 (2015).
- Martin, A. A., Richmond, J. E. The sarco(endo)plasmic reticulum calcium ATPase SCA-1 regulates the Caenorhabditis elegans nicotinic acetylcholine receptor ACR-16. Cell Calcium. 72, 104-115 (2018).
- Wang, Z., Saifee, O., Nonet, M. L., Salkoff, L. SLO-1 Potassium Channels Control Quantal Content of Neurotransmitter Release at the C. elegans Neuromuscular Junction. Neuron. 32, 867-881 (2001).
- Abraham, L. S., Oh, H. J., Sancar, F., Richmond, J. E., Kim, H. An Alpha-Catulin Homologue Controls Neuromuscular Function through Localization of the Dystrophin Complex and BK Channels in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 6 (8), 1-13 (2010).
- Gourgou, E., Chronis, N. Chemically induced oxidative stress affects ASH neuronal function and behavior in C. elegans. Scientific Reports. 6, 1-9 (2016).
- Zahratka, J. A., Williams, P. D. E., Summers, P. J., Komuniecki, R. W., Bamber, B. A. Serotonin differentially modulates Ca2+ transients and depolarization in a C. elegans nociceptor. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1041-1050 (2015).
- Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26 (3), 583-594 (2000).
- Nekimken, A. L., et al. Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap. Lab Chip. 17 (6), 1116-1127 (2017).
- Chung, S. H., Sun, L., Gabel, C. V. In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (74), 1-9 (2013).
- Jospin, M., Jacquemond, V., Mariol, M. C., Ségalat, L., Allard, B. The L-type voltage-dependent Ca2+channel EGL-19 controls body wall muscle function in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 159 (2), 337-347 (2002).
- Wabnig, S., Liewald, J. F., Yu, S., Gottschalk, A. High-Throughput All-Optical Analysis of Synaptic Transmission and Synaptic Vesicle Recycling in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. , 1-26 (2015).
