In vivo kalcium avbildning i C. elegans kropps vägg muskler
Summary
Denna metod ger ett sätt att par optogenetik och genetiskt kodade kalcium sensorer till bild baslinje cytosoliska kalciumnivåer och förändringar i framkallade kalcium transienter i kroppen väggen musklerna i modellorganismen C. elegans.
Abstract
Modellorganismen C. elegans ger ett utmärkt system för att utföra in vivo kalcium avbildning. Dess transparenta kropp och genetiska manipulabilitet möjliggör riktat uttryck för genetiskt kodade kalcium sensorer. Detta protokoll beskriver användningen av dessa sensorer för in vivo avbildning av kalciumdynamik i riktade celler, särskilt kroppen vägg musklerna i maskar. Genom att utnyttja Co-uttrycket av presynaptiska channelrhodopsin, stimulering av acetylkolin frisättning från excitatoriska motoriska nervceller kan induceras med hjälp av blått ljuspulser, vilket resulterar i muskel depolarisering och reproducerbara förändringar i cytoplasmiska kalcium Nivåer. Två mask immobilisering tekniker diskuteras med varierande svårighetsgrader. Jämförelse av dessa tekniker visar att båda metoderna bevara fysiologi den neuromuskulära korsningen och möjliggöra reproducerbara kvantifiering av kalcium transienter. Genom att para ihop optogenetik och funktionell kalcium avbildning kan förändringar i postsynaptisk kalcium hantering och homeostas utvärderas i olika mutantbakgrunder. Data som presenteras validerar både immobilisering tekniker och specifikt undersöker rollerna för C. elegans Sarco (endo) plasmatiska retikulär kalcium ATPas och kalcium-aktiverad BK kalium kanal i kroppen vägg muskel kalcium reglering.
Introduction
Denna uppsats presenterar metoder för in vivo kalcium avbildning av C. elegans kropps vägg muskler med hjälp av optogenetisk neuronala stimulering. Para ihop en muskel uttryckt genetiskt kodade kalcium indikator (GECI) med blått ljus utlöses neuronala depolarisering och ger ett system för att tydligt Observera den framkallade postsynaptiska kalcium transienter. Detta undviker användning av elektrisk stimulering, vilket möjliggör en icke-invasiv analys av mutanter som påverkar postsynaptiska kalciumdynamiken.
Single-fluorophore GECIs, såsom GCaMP, använder en enda fluorescerande proteinmolekyl smält till M13 domän myosin ljus kedjans Kinas vid dess N-terminalen slutet och calmodulin (CaM) vid C-Terminus. Vid kalcium bindning genomgår CaM-domänen, som har en hög affinitet för kalcium, en konformationsförändring som inducerar en efterföljande konformationsförändring i det fluorescerande proteinet som leder till en ökning av fluorescensintensiteten1. Gcamp fluorescens är upphetsad på 488 nm, vilket gör det olämpligt att användas tillsammans med channelrhodopsin, som har en liknande excitation våglängd på 473 nm. Således, för att par kalcium mätningar med channelrhodopsin stimulering, den gröna fluorescerande protein av GCaMP måste ersättas med ett rött fluorescerande protein, mRuby (RCaMP). Med hjälp av muskeln uttryckte RCaMP, i kombination med den kolinerga motoriska neuron uttrycket av channelrhodopsin, tillstånd studier vid masken neuromuskulära korsningen (NMJ) med samtidig användning av optogenetik och funktionell avbildning inom samma djur 2.
Användningen av channelrhodopsin kringgår behovet av elektrisk stimulering för att depolarisera de neuromuskulära korsningar av C. elegans, som endast kan uppnås i dissekerade preparat, vilket gör denna teknik både lättare att anställa och mer exakt När du riktar in dig på specifika vävnader. Till exempel har channelrhodopsin tidigare använts i C. elegans för att reversibelt aktivera specifika nervceller, vilket leder till antingen robust aktivering av excitatoriska eller hämmande neuroner3,4. Användningen av ljusstimulerad depolarisering kringtar också frågan om neuronala skador på grund av den direkta elektriska stimulering. Detta ger en möjlighet att undersöka effekterna av många olika stimulans protokoll, inklusive ihållande och upprepade stimuleringar, på postsynaptisk kalcium dynamik4.
Den genomskinliga karaktären hos C. elegans gör den idealisk för den fluorescerande Imaging funktionella analysen. Emellertid, när stimulera excitatoriska acetylkolin neuroner vid NMJ, djur förväntas svara med en omedelbar muskelkontraktion4, att göra immobilisering av maskar kritisk i visualisera diskreta kalcium förändringar. Traditionellt har farmakologiska medel använts för att paralysera djuren. En sådan drog som används är levamisole, en kolinerg acetylkolinreceptoragonist5,6,7. Eftersom Levamisol leder till ihållande aktivering av en subtyp av excitatoriska muskel receptorer, denna reagens är olämplig för studiet av muskeln kalcium dynamik. Effekten av Levamisol inducerar postsynaptisk depolarisering, upplyser cytosoliska kalcium, och ockluderande observationer efter presynaptisk stimulering. För att undvika användning av paralyserande läkemedel undersökte vi två alternativa metoder för att immobilisera C. elegans. Djuren var antingen limmade ner och sedan dissekeras öppna för att exponera kroppen väggen muskler, liknande den befintliga C. elegans NMJ elektrofysiologi metod8, eller nanobeads användes för att immobilisera intakt djur9. Båda förfarandena tillåts för reproducerbara mätningar av vilande och framkallade muskel kalcium transienter som var lätt kvantifierbara.
Metoderna i detta papper kan användas för att mäta baslinjen cytosoliska kalciumnivåer och transienter i postsynaptiska kroppen väggen muskelceller i C. elegans. Exempel på data som sysselsätter de två olika immobiliseringsteknikerna ges. Båda teknikerna utnyttjar optogenetik för att depolarisera muskelcellerna utan användning av elektrisk stimulering. Dessa exempel visar genomförbarheten av denna metod för att utvärdera mutationer som påverkar postsynaptiska kalcium hantering i maskar och påpeka för-och nackdelar med de två immobilisering metoder.
Protocol
Representative Results
Discussion
GECIs är ett kraftfullt verktyg i C. elegans neurobiologi. Tidigare arbete har utnyttjat kalcium avbildning tekniker för att undersöka en mängd olika funktioner i både nervceller och muskelceller, inklusive sensoriska och beteendemässiga svar, med olika metoder för stimulering. Vissa studier har använt kemiska stimuli för att utlösa kalcium transienter i sensoriska aska nervceller22,23 eller inducera kalcium vågor i faryngeal muskler<sup class…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Dr Alexander Gottschalk för ZX1659, den RCaMP och channelrhodopsin innehåller masken stam, Dr Hongkyun Kim för SLO-1 (eg142) Worm stam, och den nationella Bioresource projektet för SCA-1 (tm5339) Worm stam.
Materials
| all-trans retinal | Sigma-Aldrich | R2500 | Necessary for excitation of channel rhodopsin |
| Amber LED | RCaMP illumination | ||
| Arduino UNO | Mouser | 782-A000066 | Controls fluorescence illumination |
| Blue LED | channelrhodopsin illumination | ||
| BX51WI microscope | Olympus | Fixed state compound microscope | |
| Current controlled low noise linear power supply | Ametek | Sorenson | Controls LED intensity |
| Igor Pro | Wavemetrics | Wavemetrics.com | Graphing software |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov | Image processing software |
| LUMFLN 60x water NA 1.4 | Olympus | Water immersion objective for dissected preparation | |
| Master-8 Stimulator | A.M.P.I | Master timer for image acquisition and LED illumination | |
| Micro-Manager | micro-manager.org | Controls camera acquisition and LED excitiation | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
| pco.edge 4.2 CMOS camera | pco. | 4.2 | High-speed camera |
| PlanApo N 60x oil NA 1.4 | Olympus | Oil immersion objective for nanobead preparation | |
| Polybead microspheres | Polysciences, Inc. | 00876-15 | For worm immobilization |
| solid state switches | Sensata Technologies | Crydom CMX100D6 | Controls timing of LED illumination |
| Transgenic strain, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | SY1627 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with SERCA mutant allele |
| Transgenic strain, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Richmond Lab | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with calcium-activated BK potassium channel mutant allele | |
| Transgeneic strain, [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] |
Gottschalk Lab | ZX1659 | Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line |
References
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 1-29 (2013).
- Nagel, G., et al. Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses. Current Biology. 15 (24), 2279-2284 (2005).
- Liewald, J. F., et al. Optogenetic analysis of synaptic function. Nature Methods. 5 (10), 895-902 (2008).
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. Laser Microsurgery in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biology. 107, 177-206 (2012).
- Lewis, J. A., et al. Cholinergic Receptor Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 7 (10), 3059-3071 (1987).
- Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 95 (4), 905-928 (1980).
- Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature Neuroscience. 9, 791-798 (1999).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-Term Imaging of Caenorhabditis elegans Using Nanoparticle-Mediated Immobilization. PLoS ONE. 8 (1), 1-6 (2013).
- Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using umanager. Current Protocols in Molecular Biology. (Suppl 92), 1-17 (2010).
- Richmond, J. Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction. Journal of Visualized Experiments. (24), 1-4 (2009).
- Hoon Cho, J., Bandyopadhyay, J., Lee, J., Park, C. S., Ahnn, J. Two isoforms of sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) are essential in Caenorhabditis elegans. Gene. 261, 211-219 (2000).
- Zwaal, R. R., et al. The Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+ ATPase Is Required for Development and Muscle Function in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 276 (47), 43557-43563 (2001).
- Stammers, A. N., et al. The regulation of sarco(endo)plasmic reticulum calcium-ATPases (SERCA). Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 93, 1-12 (2015).
- Clapham, D. E. Calcium Signaling. Cell. 131, 1047-1058 (2007).
- Hovnanian, A. Serca pumps and human diseases. Calcium Signalling and Disease: Molecular Pathology of Calcium. , 337-363 (2007).
- Periasamy, M., Kalyanasundaram, A. SERCA pump isoforms: Their role in calcium transport and disease. Muscle and Nerve. 35 (4), 430-442 (2007).
- Gehlert, S., Bloch, W., Suhr, F. Ca2+-Dependent Regulations and Signaling in Skeletal Muscle: From Electro-Mechanical Coupling to Adaptation. International Journal of Molecular Sciences. 16, 1066-1095 (2015).
- Martin, A. A., Richmond, J. E. The sarco(endo)plasmic reticulum calcium ATPase SCA-1 regulates the Caenorhabditis elegans nicotinic acetylcholine receptor ACR-16. Cell Calcium. 72, 104-115 (2018).
- Wang, Z., Saifee, O., Nonet, M. L., Salkoff, L. SLO-1 Potassium Channels Control Quantal Content of Neurotransmitter Release at the C. elegans Neuromuscular Junction. Neuron. 32, 867-881 (2001).
- Abraham, L. S., Oh, H. J., Sancar, F., Richmond, J. E., Kim, H. An Alpha-Catulin Homologue Controls Neuromuscular Function through Localization of the Dystrophin Complex and BK Channels in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 6 (8), 1-13 (2010).
- Gourgou, E., Chronis, N. Chemically induced oxidative stress affects ASH neuronal function and behavior in C. elegans. Scientific Reports. 6, 1-9 (2016).
- Zahratka, J. A., Williams, P. D. E., Summers, P. J., Komuniecki, R. W., Bamber, B. A. Serotonin differentially modulates Ca2+ transients and depolarization in a C. elegans nociceptor. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1041-1050 (2015).
- Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26 (3), 583-594 (2000).
- Nekimken, A. L., et al. Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap. Lab Chip. 17 (6), 1116-1127 (2017).
- Chung, S. H., Sun, L., Gabel, C. V. In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (74), 1-9 (2013).
- Jospin, M., Jacquemond, V., Mariol, M. C., Ségalat, L., Allard, B. The L-type voltage-dependent Ca2+channel EGL-19 controls body wall muscle function in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 159 (2), 337-347 (2002).
- Wabnig, S., Liewald, J. F., Yu, S., Gottschalk, A. High-Throughput All-Optical Analysis of Synaptic Transmission and Synaptic Vesicle Recycling in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. , 1-26 (2015).
