Vi præsenterer her, en forbedret gær one-hybrid screening protokol for at identificere de transkriptionsfaktorer (TFs), der kan bindes til en menneskelig DNA region af interesse. Denne metode bruger en høj overførselshastighed screening rørledning, der kan forhøre bindingen af > 1.000 TFs i et enkelt eksperiment.
At identificere sæt af transkriptionsfaktorer (TFs), der regulerer hvert menneskelige gen er en skræmmende opgave, der kræver integration af talrige eksperimentelle og beregningsmæssige metoder. En sådan metode er gær one-hybrid (Y1H) assay, i hvilke interaktioner mellem TFs og DNA regioner er testet i milieu af gær kernen bruger reporter gener. Y1H assays involverer to komponenter: en ‘DNA-agn’ (fx., projektledere, smagsforstærkere, lyddæmpere, etc.) og ‘TF-bytte,’ som kan blive screenet for reporter genaktivering. Mest publicerede protokoller til at udføre Y1H skærme er baseret på omdanne TF-bytte biblioteker eller matrixer til DNA-agn gærstammer. Her, vi beskriver en rørledning, kaldet udvidet Y1H (eY1H)-undersøgelser, hvor TF-DNA interaktioner er afhørt af parring DNA-agn stammer med en klædt samling af TF-bytte stammer ved hjælp af en høj tæthed vifte (HDA) robot platform, der giver mulighed for screening i en 1,536 koloni format. Dette giver mulighed for en dramatisk stigning i overførselshastighed (60 DNA-agn sekvenser mod > 1.000 TFs tager to uger per forsker) og reproducerbarhed. Vi illustrere de forskellige typer af forventede resultater ved at teste menneskelige promotor sekvenser mod en bred vifte af 1,086 menneskelige TFs, samt eksempler på problemer, der kan opstå under skærme og fejlfinding af dem.
Et centralt problem i den biomedicinske felt er at fastlægge de mekanismer, hvorved hver menneskeligt gen er reguleret. Transskription er det første skridt i at kontrollere gen expression niveauer, og det er reguleret af sæt af transkriptionsfaktorer (TFs), der er unikke for hvert Gen. I betragtning af at mennesker indkode > 1.500 TFs1,2, identificerer det komplette sæt af TFs, der styrer udtryk for hvert gen forbliver en åben udfordring.
To typer af metoder kan bruges til at knytte TF-DNA interaktioner: TF-centreret og DNA-centreret metoder3 (figur 1A). I TF-centreret metoder aftestede en TF af interesse for bindende genomisk DNA regioner eller til at bestemme dens DNA bindende specificitet. Disse metoder omfatter kromatin immunoprecipitation (ChIP) efterfulgt af høj overførselshastighed sekventering, protein bindende microarrays og SELEX4,5,6. I DNA-centreret metoder, er en DNA-sekvens af interesse aftestede for at bestemme sæt af TFs, der binder sig til DNA-sekvens. De mest almindeligt anvendte af sådanne metoder er gær one-hybrid (Y1H) assays, i hvilke interaktioner mellem TFs og DNA regioner er testet i milieu af gær kernen bruger reporter gener7,8,9.
Y1H assays involverer to komponenter: en ‘DNA-agn’ (f.eks. promotorer, smagsforstærkere, lyddæmpere, etc.) og ‘TF-bytte,’ som kan blive screenet for reporter gen aktivering9,10 (figur 1B). DNA-agn er klonet opstrøms af to reporter gener (LacZ og HIS3) og begge DNA-bait::reporter konstruktioner er integreret i gær genom til at generere chromatinized ‘DNA-agn stammer.» TF-bytte, kodet i et plasmid, der udtrykker en TF smeltet til aktivering domæne (AD) af gær Gal4 TF, er indført i DNA-agn stammen til at fiske efter TF-DNA interaktioner. Hvis TF-bytte binder sig til DNA-agn sekvens, vil så Annoncen aktuelle i TF-bytte føre til aktivering af begge reporter gener. Celler med en positiv interaktion kan som følge heraf valgt for vækst på plader mangler histidin, samt at overvinde en kompetitiv inhibitor, 3-Amino-1,2,4-fungiciderne (3-AT), og visualiseres som blå kolonier i overværelse af X-gal. Fordi den potente gær Gal4 AD bruges, Y1H assays kan registrere interaktioner, der vedrører transcriptional aktivatorer samt repressors. Hertil kommer, at TF-byttedyr udtrykkes fra en stærk gær promotor (ADH1), kan interaktioner påvises selv for TFs, der har lav endogen udtryk niveauer, som udfordrende for at påvise ved ChIP11,12.
Mest publicerede protokoller til at udføre Y1H assays er baseret på at indføre TF-byttedyr i DNA-agn gærstammer ved at omdanne poolede TF-bytte biblioteker efterfulgt af udvælgelse, koloni picking og rækkefølge for at identificere de interagerende TF, eller ved omdanne enkelte kloner8,9. Disse er tidskrævende protokoller, begrænse antallet af DNA-sekvenser, der kan testes pr. forsker. En nylig forbedring af Y1H assays, kaldet udvidet Y1H (eY1H), steget dramatisk screening overførselshastighed ved hjælp af en høj tæthed array (HDA) robot platform for at parre gærstammer DNA-agn med en samling af gærstammer hver udtryk for en anden TF-bytte10,13 (figur 1 c). Disse skærme anvender en 1,536 koloni format gør det muligt at teste mest menneskelige TFs i fire eksemplarer ved hjælp af kun tre plader. Yderligere, at TF-DNA interaktioner er testet på en måde, parvis, denne tilgang giver mulighed for sammenligning af interaktioner mellem DNA-lokkemad (f.eks. to noncoding enkelt nucleotid varianter) og mellem forskellige TFs eller TF varianter11,12 ,14.
Bruger eY1H assays, har vi afgrænset største menneskelige og Caenorhabditis elegans DNA-centreret TF-DNA interaktioner netværk til dato. Især har vi identificeret 2,230 interaktioner mellem 246 menneskelige udviklingsmæssige smagsforstærkere og 283 TFs12. Derudover har vi ansat eY1H assays til at afdække ændrede TF binding til 109 enkelt nucleotid noncoding varianter forbundet med genetiske sygdomme som udviklingsmæssige misdannelser, kræft og neurologiske lidelser. Mere nylig, vi brugte eY1H til at afgrænse et netværk bestående af 21,714 interaktioner mellem 2,576 C. elegans gen initiativtagere og 366 TFs11. Dette netværk var medvirkende til at afdække snesevis af C. elegans TFs funktionelle rolle.
Protokoller til at generere DNA-agn pletter og vurdere niveauet af baggrunden reporter aktivitet har været rapporteret et andet sted15,16,17. Her, beskriver vi en eY1H rørledning, der kan bruges til at screene nogen humant genomisk DNA region mod en bred vifte af 1,086 menneskelige TFs. Når en gær DNA-agn stamme er genereret og en TF-bytte array er spottet på de tilsvarende plader, kan den hele protokol udføres i to uger (tabel 1). Endnu vigtigere, kan protokollen parallelized således at en enkelt forsker kan skærmen 60 DNA-agn sekvenser samtidigt. For at demonstrere protokollen, screenet vi initiativtagerne til to cytokin gener CCL15 og IL17F. Derudover viser vi resultater fra mislykkede skærme til at illustrere typerne problemer, der kan opstå, når du udfører eY1H assays og fejlfinding af dem.
Robotic eY1H parring screening tilgang beskrevet her kraftigt øger gennemløb for at identificere sæt af TFs, der binder sig til DNA region af interesse, i forhold til tidligere bibliotek screening eller klædt screening tilgange baseret på transformation. Yderligere, TF-DNA interaktioner opdaget af eY1H assays er yderst reproducerbare som 90% af interaktioner opdaget er positiv for alle fire kolonier testet pr. TF, og 90% af interaktioner retest i en uafhængig skærm af samme gær DNA-agn stamme10<…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health [R35-GM128625 til J.I.F.B.].
3-Amino-1,2,4-triazole (3AT) ~95 % TLC | Sigma | A8056-100G | Competitive inhibitor for products of HIS3 gene |
Adenine sulfate (hemisulfate), dihydrate | US Biologicals | A0865 | Required for proper yeast growth |
Agar High Gel Strength – Bacteriological grade | American International Chemical | AGHGUP | Nutritive media for yeast growth |
Ammonium Sulfate | US Biologicals | A1450 | Nitrogen source in synthetic yeast media |
D+ Glucose Anhydrous | US Biologicals | G3050 | Required for yeast growth |
Drop-Out Mix minus His, Leu, Tryp and Uracil, adenine rich w/o yeast nitrogen base | US Biologicals | D9540-02 | Synthetic complete media required for yeast growth |
edge Multiparameter pH Meter | Hanna Instruments | HI2020-01 | To measure pH of selective media |
Flat Toothpicks 750ct | Diamond | To streak yeasts on petridishes | |
Glass Beads | Walter Stern | 100C | To spreak yeast when making lawns |
Glycerol ≥99% | Millipore Sigma | G9012-1L | Required to make frozen yeast stocks |
L-Histidine | US Biologicals | H5100 | For yeast growth selection in selective media |
L-Leucine | US Biologicals | L2020-05 | For yeast growth selection in selective media |
L-Tryptophan | Sigma | T-0254 | For yeast growth selection in selective media |
N,N-Dimethylformamide | Sigma | 319937-1L | To make X-gal solution |
Omnipense Elite | Wheaton | W375030-A | For dispensing accurate volumes of media into Singer plates |
Peptone, Bacteriological | American International Chemical | PEBAUP | Protein source required for yeast growth |
Petri Dish, 150×15 mm | VWR | 10753-950 | For growing yeast baits for screening |
PlusPlates | Singer Instruments | PLU-003 | To make rectangular agar plates to use with Singer Robot |
Precision Low Temperature BOD Refrigerated Incubator | ThermoFisher Scientific | PR205745R | To incubate yeast plates at constant temperature |
RePads 1,536 short | Singer Instruments | REP-005 | To transfer the TF-prey array, mate yeast, and transfer yeast to diploid selection and readout plates |
RePads 384 short | Singer Instruments | REP-004 | To transfer TF-prey array from 384 to 1,536 colony format |
RePads 96 long | Singer Instruments | REP-001 | To transfer TF-prey array from glycerol stock to agar plate |
RePads 96 short | Singer Instruments | REP-002 | To transfer TF-prey array from 96 to 384 colony format |
Singer HDA RoToR robot | Singer Instruments | For transfering yeast in high-throughput manner | |
Sodium Hydroxide (Pellets/Certified ACS) | Fisher | S318-1 | For adjusting pH of selective media |
Sodium Phosphate dibasic heptahydrate | Santa Cruz Biotechnology | sc-203402C | Required for LacZ reporter activity on X-gal |
Sodium Phosphate monobasic monohydrate | Santa Cruz Biotechnology | sc-202342B | Required for LacZ reporter activity on X-gal |
Uracil | Sigma | U0750-100G | For yeast growth selection in selective media |
X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside) | Gold Biotechnology | X4281C100 | β-galactosidase turns colorless X-gal blue to detect protein-DNA interaction |
Yeast Extract | US Biologicals | Y2010 | Nutritious medium for growth and propagation of yeast |
Yeast Nitrogen Base (powder) w/o AA, carbohydrate and w/o AS | US Biologicals | Y2030 | Required for vigorous yeast growth |