Telas de um híbrido levedura melhorada para identificar o fator de transcrição, vinculando a sequências de DNA humano
Summary
Aqui, apresentamos uma levedura melhorada híbrido-um protocolo para identificar os fatores de transcrição (TFs) que podem ligar a uma região de DNA humana de interesse de triagem. Esse método usa um pipeline de rastreio com throughput alto que pode interrogar a vinculação de > 1.000 TFs em uma única experiência.
Abstract
Identificar os conjuntos de factores de transcrição (TFs) que regulam cada gene humano é uma tarefa difícil que requer a integração de diversas abordagens experimentais e computacionais. Um tal método é o ensaio (Y1H) um híbrido do fermento, em qual dessas interações entre TFs e DNA regiões são testadas no meio do núcleo fermento usando genes repórter. Y1H ensaios envolvem dois componentes: uma ‘DNA-isca’ (ex.., promotores, melhoradores, silenciadores, etc.) e um ‘TF-presas,’ que podem ser rastreada para ativação do gene repórter. Mais protocolos publicados para a realização de telas Y1H são baseados em transformar bibliotecas TF-presa ou matrizes em cepas de leveduras de DNA-isca. Aqui, descrevemos um pipeline, chamado Y1H reforçada (eY1H) os ensaios, onde interações TF-DNA são interrogadas por linhagens de DNA-isca com uma coleção de matriz de cepas de TF-presas usando uma matriz de alta densidade de acasalamento plataforma de robótica (HDA) que permite o rastreio em um 1.536 formato de colônia. Isto permite um aumento dramático na taxa de transferência (60 sequências de DNA-isca contra > 1.000 TFs leva duas semanas por pesquisador) e reprodutibilidade. Ilustraremos os diferentes tipos de resultados esperados através do teste de sequências de promotor humano contra uma matriz de 1.086 TFs humano, bem como exemplos de problemas que podem surgir durante as telas e como solucioná-los.
Introduction
Um problema central no campo biomédico é determinar os mecanismos pelo qual cada gene humano é regulamentado. Transcrição é o primeiro passo para controlar os níveis de expressão do gene, e ela é regulada por conjuntos de fatores de transcrição (TFs) que são exclusivos para cada gene. Dado que os seres humanos codificam para > 1.500 TFs1,2, identificando o conjunto completo do TFs que controlam a expressão de cada gene permanece um desafio aberto.
Dois tipos de métodos podem ser usados para mapear interações TF-DNA: TF-centrado e centrada no DNA métodos3 (figura 1A). Em métodos TF-centrado, um TF de interesse é sondada para ligação para regiões de DNA genômicas ou para determinar a sua especificidade de ligação do DNA. Estes métodos incluem imunoprecipitação da cromatina (ChIP) seguida por sequenciamento de alta produtividade, microarrays de ligação da proteína e SELEX4,5,6. Em métodos centrado no DNA, uma sequência de DNA de interesse é analisada para determinar o conjunto de TFs que ligam para a sequência do DNA. A mais amplamente aplicada de tais métodos é fermento um híbrido (Y1H) os ensaios, no quais as interações entre TFs e DNA regiões são testadas no meio do núcleo fermento usando o repórter genes7,8,9.
Y1H ensaios envolvem dois componentes: uma ‘DNA-isca’ (por exemplo, promotores, melhoradores, silenciadores, etc) e um ‘TF-presas,’ que podem ser rastreada para repórter gene ativação9,10 (figura 1B). A isca de ADN clonada montante de repórter dois genes (LacZ e HIS3) e ambas as construções do DNA-bait::reporter estão integradas no genoma da levedura para gerar chromatinized ‘linhagens de DNA-isca’. A TF-presa, codificada em um plasmídeo que expressa um TF fundido-se ao domínio de ativação (AD) da levedura Gal4 TF, é introduzida a estirpe de DNA-isca para pescar interações TF-DNA. Se o TF-rapina vincula-se à sequência de DNA-isca, o anúncio presente na rapina TF levará para a ativação de ambos os genes repórter. Como resultado, as células com uma interação positiva podem ser selecionadas para o crescimento em placas faltando histidina, bem como a superação de um inibidor competitivo, 3-Amino-1, 2,4-triazole (3-a) e visualizadas como colônias azuis na presença de X-gal. Porque o fermento potente Gal4 AD é usado, os ensaios de Y1H podem detectar interações envolvendo ativadores transcricionais, bem como repressores. Além disso, dado que TF-presas são expressos de um promotor forte de fermento (ADH1), interações podem ser detectadas mesmo para TFs com níveis de baixa expressão endógena, que são um desafio para detectar por ChIP11,12.
Mais protocolos publicados para a realização de ensaios de Y1H são baseados em introduzir as cepas de leveduras DNA-isca TF-presas, transformando-se em pool TF-rapina bibliotecas, seguidas por seleção, colônia escolhendo e sequenciamento para identificar o TF interagindo, ou por transformação individual clones8,9. Estes são protocolos demorados, limitando o número de sequências de DNA que podem ser testados por pesquisador. Uma recente melhoria dos ensaios de Y1H, chamado enhanced Y1H (eY1H), aumentou drasticamente a taxa de transferência de rastreio usando uma plataforma robótica de matriz (HDA) de alta densidade para acasalar cepas de leveduras DNA-isca com uma coleção de cepas de leveduras, cada uma expressando uma diferente TF-rapina10,13 (Figura 1). Estas telas empregam uma 1.536 colônia formato permitindo testar TFs mais humano em quadriplicado usando apenas três pratos. Além disso, dado que as interações TF-DNA são testadas de forma emparelhada, esta abordagem permite comparando interações entre DNA-iscas (como duas variantes de nucleotídeo único não-codificante) e entre diferente TFs ou variantes TF11,12 ,14.
Utilizando ensaios de eY1H, foram delineados os humanos maiores e Caenorhabditis elegans TF centrado no DNA-DNA interações redes até à data. Em particular, nós identificamos 2.230 interações entre 246 potenciadores do desenvolvimento humanos e 283 TFs12. Além disso, nós empregamos eY1H ensaios para descobrir a ligação de TF alterada para 109 variantes não-codificante de nucleotídeo único associados a doenças genéticas como a malformação do desenvolvimento, câncer e doenças neurológicas. Mais recentemente, nós costumávamos eY1H delinear uma rede composta por 21.714 interações entre 2.576 promotores de genes de c. elegans e 366 TFs11. Esta rede foi fundamental para desvendar o papel funcional de dezenas de c. elegans TFs.
Os protocolos para gerar manchas de DNA-isca e avaliar os níveis de atividade de repórter de fundo tem sido relatado em outro lugar15,16,17. Aqui, descrevemos um pipeline de eY1H que pode ser usado para qualquer região de DNA genômico humano contra uma matriz de 1.086 TFs humana de tela. Uma vez que uma estirpe de DNA-isca de levedura é gerada e uma matriz de TF-presa está manchado nas chapas de correspondente, o protocolo inteiro pode ser executado em duas semanas (tabela 1). Mais importante, o protocolo pode ser colocado em paralelo para que um único pesquisador pode tela 60 sequências de DNA-isca simultaneamente. Para demonstrar o protocolo, nós selecionados promotores do cytokine os genes CCL15 e IL17F. Além disso, mostramos resultados de falhadas telas para ilustrar os tipos de problemas que possam surgir durante a execução de ensaios de eY1H e como solucioná-los.
Protocol
Representative Results
Discussion
A abordagem eY1H robótico acasalamento triagem descrita aqui grandemente aumenta o throughput para identificar o conjunto de TFs que se ligam a uma região de DNA de interesse, em comparação com o anterior rastreio de biblioteca ou triagem matriz abordagens baseadas na transformação. Além disso, as interações de TF-DNA detectadas pelo eY1H ensaios são altamente reprodutíveis como 90% das interações detectadas são positivos para todos os quatro colônias testado por TF, e 90% das interações reteste em uma t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health [R35-GM128625 de J.I.F.B.].
Materials
| 3-Amino-1,2,4-triazole (3AT) ~95 % TLC | Sigma | A8056-100G | Competitive inhibitor for products of HIS3 gene |
| Adenine sulfate (hemisulfate), dihydrate | US Biologicals | A0865 | Required for proper yeast growth |
| Agar High Gel Strength – Bacteriological grade | American International Chemical | AGHGUP | Nutritive media for yeast growth |
| Ammonium Sulfate | US Biologicals | A1450 | Nitrogen source in synthetic yeast media |
| D+ Glucose Anhydrous | US Biologicals | G3050 | Required for yeast growth |
| Drop-Out Mix minus His, Leu, Tryp and Uracil, adenine rich w/o yeast nitrogen base | US Biologicals | D9540-02 | Synthetic complete media required for yeast growth |
| edge Multiparameter pH Meter | Hanna Instruments | HI2020-01 | To measure pH of selective media |
| Flat Toothpicks 750ct | Diamond | To streak yeasts on petridishes | |
| Glass Beads | Walter Stern | 100C | To spreak yeast when making lawns |
| Glycerol ≥99% | Millipore Sigma | G9012-1L | Required to make frozen yeast stocks |
| L-Histidine | US Biologicals | H5100 | For yeast growth selection in selective media |
| L-Leucine | US Biologicals | L2020-05 | For yeast growth selection in selective media |
| L-Tryptophan | Sigma | T-0254 | For yeast growth selection in selective media |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma | 319937-1L | To make X-gal solution |
| Omnipense Elite | Wheaton | W375030-A | For dispensing accurate volumes of media into Singer plates |
| Peptone, Bacteriological | American International Chemical | PEBAUP | Protein source required for yeast growth |
| Petri Dish, 150×15 mm | VWR | 10753-950 | For growing yeast baits for screening |
| PlusPlates | Singer Instruments | PLU-003 | To make rectangular agar plates to use with Singer Robot |
| Precision Low Temperature BOD Refrigerated Incubator | ThermoFisher Scientific | PR205745R | To incubate yeast plates at constant temperature |
| RePads 1,536 short | Singer Instruments | REP-005 | To transfer the TF-prey array, mate yeast, and transfer yeast to diploid selection and readout plates |
| RePads 384 short | Singer Instruments | REP-004 | To transfer TF-prey array from 384 to 1,536 colony format |
| RePads 96 long | Singer Instruments | REP-001 | To transfer TF-prey array from glycerol stock to agar plate |
| RePads 96 short | Singer Instruments | REP-002 | To transfer TF-prey array from 96 to 384 colony format |
| Singer HDA RoToR robot | Singer Instruments | For transfering yeast in high-throughput manner | |
| Sodium Hydroxide (Pellets/Certified ACS) | Fisher | S318-1 | For adjusting pH of selective media |
| Sodium Phosphate dibasic heptahydrate | Santa Cruz Biotechnology | sc-203402C | Required for LacZ reporter activity on X-gal |
| Sodium Phosphate monobasic monohydrate | Santa Cruz Biotechnology | sc-202342B | Required for LacZ reporter activity on X-gal |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | For yeast growth selection in selective media |
| X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside) | Gold Biotechnology | X4281C100 | β-galactosidase turns colorless X-gal blue to detect protein-DNA interaction |
| Yeast Extract | US Biologicals | Y2010 | Nutritious medium for growth and propagation of yeast |
| Yeast Nitrogen Base (powder) w/o AA, carbohydrate and w/o AS | US Biologicals | Y2030 | Required for vigorous yeast growth |
References
- Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. A census of human transcription factors: function, expression and evolution. Nature Reviews Genetics. 10 (4), 252-263 (2009).
- Lambert, S. A., et al. The Human Transcription Factors. Cell. 172 (4), 650-665 (2018).
- Arda, H. E., Walhout, A. J. Gene-centered regulatory networks. Briefings in Functional Genomics. 9 (1), 4-12 (2010).
- Jolma, A., et al. DNA-binding specificities of human transcription factors. Cell. 152 (1-2), 327-339 (2013).
- Bulyk, M. L., Gentalen, E., Lockhart, D. J., Church, G. M. Quantifying DNA-protein interactions by double-stranded DNA arrays. Nature Biotechnology. 17 (6), 573-577 (1999).
- Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).
- Li, J. J., Herskowitz, I. Isolation of ORC6, a component of the yeast origin recognition complex by a one-hybrid system. Science. 262 (5141), 1870-1874 (1993).
- Sewell, J. A., Fuxman Bass, J. I. Options and Considerations When Using a Yeast One-Hybrid System. Methods in Molecular Biology. 1794, 119-130 (2018).
- Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Gene-Centered Yeast One-Hybrid Assays. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
- Reece-Hoyes, J. S., et al. Enhanced yeast one-hybrid assays for high-throughput gene-centered regulatory network mapping. Nature Methods. 8 (12), 1059-1064 (2011).
- Fuxman Bass, J. I., et al. A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network provides a framework for functional predictions. Molecular Systems Biology. 12 (10), 884 (2016).
- Fuxman Bass, J. I., et al. Human gene-centered transcription factor networks for enhancers and disease variants. Cell. 161 (3), 661-673 (2015).
- Reece-Hoyes, J. S., et al. Yeast one-hybrid assays for gene-centered human gene regulatory network mapping. Nature Methods. 8 (12), 1050-1052 (2011).
- Sahni, N., et al. Widespread macromolecular interaction perturbations in human genetic disorders. Cell. 161 (3), 647-660 (2015).
- Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Generating Bait Strains for Yeast One-Hybrid Assays. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
- Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Colony Lift Colorimetric Assay for beta-Galactosidase Activity. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
- Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Zymolyase-Treatment and Polymerase Chain Reaction Amplification from Genomic and Plasmid Templates from Yeast. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
- Deplancke, B., et al. A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network. Cell. 125 (6), 1193-1205 (2006).
- Reece-Hoyes, J. S., et al. Extensive rewiring and complex evolutionary dynamics in a C. elegans multiparameter transcription factor network. Molecular Cell. 51 (1), 116-127 (2013).
- Carrasco Pro, S., et al. Global landscape of mouse and human cytokine transcriptional regulation. Nucleic Acids Research. 46 (18), 9321-9337 (2018).
- Whitfield, T. W., et al. Functional analysis of transcription factor binding sites in human promoters. Genome Biology. 13 (9), R50 (2012).
- Fuxman Bass, J. I., et al. Transcription factor binding to Caenorhabditis elegans first introns reveals lack of redundancy with gene promoters. Nucleic Acids Research. 42 (1), 153-162 (2014).
- Hens, K., et al. Automated protein-DNA interaction screening of Drosophila regulatory elements. Nature Methods. 8 (12), 1065-1070 (2011).
- Gubelmann, C., et al. A yeast one-hybrid and microfluidics-based pipeline to map mammalian gene regulatory networks. Molecular Systems Biology. 9, 682 (2013).
- Brady, S. M., et al. A stele-enriched gene regulatory network in the Arabidopsis root. Molecular Systems Biology. 7, 459 (2011).
- Pruneda-Paz, J. L., et al. A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors. Cell Reports. 8 (2), 622-632 (2014).
- Burdo, B., et al. The Maize TFome–development of a transcription factor open reading frame collection for functional genomics. The Plant Journal. 80 (2), 356-366 (2014).
